Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.
Ces dernières années, le nombre d’études consacrées à la détermination du lien entre les mitochondries et le cancer a considérablement augmenté. Cependant, des efforts supplémentaires sont encore nécessaires pour bien comprendre le lien impliquant des altérations dans les mitochondries et la tumorigenèse, ainsi que pour identifier les phénotypes mitochondriaux associés aux tumeurs. Par exemple, pour évaluer la contribution des mitochondries dans les processus de tumorigenèse et de métastase, il est essentiel de comprendre l’influence des mitochondries des cellules tumorales dans différents environnements nucléaires. À cette fin, une approche possible consiste à transférer les mitochondries dans un fond nucléaire différent pour obtenir les cellules dites cybrides. Dans les techniques traditionnelles de cybridisation, une lignée cellulaire dépourvue d’ADNmt (ρ0, cellule donneuse nucléaire) est repeuplée avec des mitochondries dérivées de cellules énucléées ou de plaquettes. Cependant, le processus d’énucléation nécessite une bonne adhérence cellulaire à la plaque de culture, une caractéristique qui est partiellement ou complètement perdue dans de nombreux cas dans les cellules invasives. En outre, une autre difficulté trouvée dans les méthodes traditionnelles est d’obtenir l’élimination complète de l’ADNmt endogène de la lignée cellulaire mitochondriale réceptrice pour obtenir des arrière-plans d’ADN nucléaire et mitochondrial pur, évitant ainsi la présence de deux espèces d’ADNmt différentes dans la cybride générée. Dans ce travail, nous présentons un protocole d’échange mitochondrial appliqué aux cellules cancéreuses en suspension basée sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées. Cette méthodologie nous permet de surmonter les limites des approches traditionnelles et peut donc être utilisée comme un outil pour élargir la compréhension du rôle mitochondrial dans la progression du cancer et les métastases.
La reprogrammation du métabolisme énergétique est une caractéristique du cancer1 qui a été observé pour la première fois par Otto Warburg dans les années 19302. Dans des conditions aérobies, les cellules normales convertissent le glucose en pyruvate, qui génère ensuite de l’acétyl-coA, alimentant la machinerie mitochondriale et favorisant la respiration cellulaire. Néanmoins, Warburg a démontré que, même dans des conditions normoxiques, la plupart des cellules cancéreuses convertissent le pyruvate obtenu par le processus de glycolyse en lactate, changeant leur façon d’obtenir de l’énergie. Cet ajustement métabolique est connu sous le nom d’« effet Warburg » et permet à certaines cellules cancéreuses de répondre à leurs besoins énergétiques pour une croissance et une division rapides, malgré la génération d’ATP moins efficace que le processus aérobie 3,4,5. Au cours des dernières décennies, de nombreux travaux ont soutenu l’implication de la reprogrammation du métabolisme dans la progression du cancer. Par conséquent, l’énergétique tumorale est considérée comme une cible intéressante contre le cancer1. En tant que plaque tournante du métabolisme énergétique et de l’approvisionnement en précurseurs essentiels, les mitochondries jouent un rôle clé dans ces adaptations cellulaires que, à ce jour, nous ne comprenons que partiellement.
Conformément à ce qui précède, des mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été proposées comme l’une des causes possibles de cette reprogrammation métabolique, ce qui pourrait entraîner une altération de la performance de la chaînede transport d’électrons (ETC) 6 et expliquerait pourquoi certaines cellules cancéreuses améliorent leur métabolisme glycolytique pour survivre. En effet, il a été rapporté que l’ADNmt accumule des mutations au sein des cellules cancéreuses, étant présent dans au moins 50% destumeurs7. Par exemple, une étude récente menée par Yuan et al. a rapporté la présence de molécules d’ADNmt hypermutées et tronquées dans les cancers du rein, colorectal et thyroïdien8. De plus, de nombreux travaux ont démontré que certaines mutations de l’ADNmt sont associées à un phénotype tumoral plus agressif et à une augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses 9,10,11,12,13,14,15,16.
Malgré la pertinence apparente du génome mitochondrial dans la progression du cancer, l’étude de ces mutations et de leur contribution à la maladie a été difficile en raison des limites des modèles expérimentaux et des technologies actuellement disponibles17. Ainsi, de nouvelles techniques pour comprendre l’impact réel de l’ADN mitochondrial dans le développement et la progression de la maladie cancéreuse sont nécessaires. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pour la génération de cybrides transmitochondriales à partir de cellules cancéreuses en suspension à croissance, basé sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées, qui surmonte les principaux défis des méthodes traditionnelles de cybridisation18,19. Cette méthodologie permet l’utilisation de n’importe quel donneur de noyaux, indépendamment de la disponibilité de leur lignée cellulaire ρ0 correspondante et le transfert de mitochondries à partir de cellules qui, selon les techniques traditionnelles, seraient difficiles à énucléer (c’est-à-dire des lignées cellulaires non adhérentes).
Depuis qu’Otto Warburg a rapporté que les cellules cancéreuses modifient leur métabolisme et potentialisent la « glycolyse aérobie »3,4 tout en réduisant la respiration mitochondriale, l’intérêt pour le rôle des mitochondries dans la transformation et la progression du cancer a augmenté de façon exponentielle. Ces dernières années, des mutations dans l’ADNmt et le dysfonctionnement mitochondrial ont été postulés comme caractéristiques de n…
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par les numéros de subvention PID2019-105128RB-I00 à RSA, JMB et AA, et PGC2018-095795-B-I00 à PFS et RML, toutes deux financées par MCIN/AEI/10.13039/501100011033 et les numéros de subvention B31_20R (RSA, JMA et AA) et E35_17R (PFS et RML) et financées par Gobierno de Aragón. Le travail de RSA a été soutenu par une subvention de l’Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Les auteurs tiennent à souligner l’utilisation du Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |