Questo protocollo descrive una tecnica per la generazione di cibridi da cellule tumorali in sospensione come strumento per studiare il ruolo dei mitocondri nel processo tumorigenico.
Negli ultimi anni, il numero di studi dedicati ad accertare la connessione tra mitocondri e cancro è aumentato in modo significativo. Tuttavia, sono ancora necessari ulteriori sforzi per comprendere appieno il legame che coinvolge le alterazioni nei mitocondri e nella tumorigenesi, nonché per identificare i fenotipi mitocondriali associati al tumore. Ad esempio, per valutare il contributo dei mitocondri nei processi di tumorigenesi e metastasi, è essenziale comprendere l’influenza dei mitocondri dalle cellule tumorali in diversi ambienti nucleari. A tal fine, un possibile approccio consiste nel trasferire i mitocondri in un diverso background nucleare per ottenere le cosiddette cellule cibridi. Nelle tecniche tradizionali di cibridizzazione, una linea cellulare priva di mtDNA (ρ0, cellula donatrice nucleare) viene ripopolata con mitocondri derivati da cellule enucleate o piastrine. Tuttavia, il processo di enucleazione richiede una buona adesione cellulare alla piastra di coltura, una caratteristica che viene parzialmente o completamente persa in molti casi nelle cellule invasive. Inoltre, un’altra difficoltà riscontrata nei metodi tradizionali è quella di ottenere la completa rimozione del mtDNA endogeno dalla linea cellulare mitocondriale-ricevente per ottenere sfondi di DNA nucleare e mitocondriale puro, evitando la presenza di due diverse specie di mtDNA nel cibride generato. In questo lavoro, presentiamo un protocollo di scambio mitocondriale applicato alle cellule tumorali in sospensione in crescita basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati. Questa metodologia ci consente di superare i limiti degli approcci tradizionali e quindi può essere utilizzata come strumento per espandere la comprensione del ruolo mitocondriale nella progressione del cancro e nelle metastasi.
Riprogrammare il metabolismo energetico è un segno distintivo del cancro1 che è stato osservato per la prima volta da Otto Warburg nel 19302. In condizioni aerobiche, le cellule normali convertono il glucosio in piruvato, che poi genera acetil-coA, alimentando il macchinario mitocondriale e promuovendo la respirazione cellulare. Tuttavia, Warburg ha dimostrato che, anche in condizioni normossiche, la maggior parte delle cellule tumorali converte il piruvato ottenuto dal processo di glicolisi in lattato, spostando il loro modo di ottenere energia. Questo aggiustamento metabolico è noto come “effetto Warburg” e consente ad alcune cellule tumorali di soddisfare le loro richieste energetiche di crescita rapida e divisione, nonostante generino ATP in modo meno efficiente rispetto al processo aerobico 3,4,5. Negli ultimi decenni, numerosi lavori hanno supportato l’implicazione della riprogrammazione del metabolismo nella progressione del cancro. Quindi, l’energetica del tumore è considerata un obiettivo interessante contro il cancro1. Come hub centrale nel metabolismo energetico e nella fornitura di precursori essenziali, i mitocondri svolgono un ruolo chiave in questi adattamenti cellulari che, ad oggi, comprendiamo solo parzialmente.
In linea con quanto sopra, le mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) sono state proposte come una delle possibili cause di questa riprogrammazione metabolica, che potrebbe portare a una ridotta prestazione della catena di trasporto degli elettroni (ETC)6 e spiegherebbe perché alcune cellule tumorali migliorano il loro metabolismo glicolitico per sopravvivere. Infatti, è stato riportato che il mtDNA accumula mutazioni all’interno delle cellule tumorali, essendo presente in almeno il 50% dei tumori7. Ad esempio, un recente studio condotto da Yuan et al. ha riportato la presenza di molecole di mtDNA ipermutate e troncate nei tumori del rene, del colon-retto e della tiroide8. Inoltre, molti lavori hanno dimostrato che alcune mutazioni del mtDNA sono associate ad un fenotipo tumorale più aggressivo e ad un aumento del potenziale metastatico delle cellule tumorali 9,10,11,12,13,14,15,16.
Nonostante l’apparente rilevanza del genoma mitocondriale nella progressione del cancro, lo studio di queste mutazioni e il loro contributo alla malattia sono stati difficili a causa delle limitazioni nei modelli sperimentali e nelle tecnologie attualmente disponibili17. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per comprendere il reale impatto del DNA dei mitocondri nello sviluppo e nella progressione della malattia del cancro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo per la generazione di cibridi transmitocondriali da cellule tumorali in crescita in sospensione, basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati, che supera le principali sfide dei metodi tradizionali di cibridizzazione18,19. Questa metodologia consente l’utilizzo di qualsiasi nucleo donatore indipendentemente dalla disponibilità della corrispondente linea cellulare ρ0 e il trasferimento di mitocondri da cellule che, seguendo le tecniche tradizionali, sarebbero difficili da enucleare (cioè linee cellulari non aderenti).
Da quando Otto Warburg ha riferito che le cellule tumorali spostano il loro metabolismo e potenziano la “glicolisi aerobica”3,4 riducendo la respirazione mitocondriale, l’interesse per il ruolo dei mitocondri nella trasformazione e nella progressione del cancro è cresciuto esponenzialmente. Negli ultimi anni, le mutazioni nel mtDNA e la disfunzione mitocondriale sono state postulate come segni distintivi di molti tipi di cancro25. Ad oggi…
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata finanziata dal numero di sovvenzione PID2019-105128RB-I00 a RSA, JMB e AA e PGC2018-095795-B-I00 a PFS e RML, entrambi finanziati da MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 e numeri di sovvenzione B31_20R (RSA, JMA e AA) e E35_17R (PFS e RML) e finanziato da Gobierno de Aragón. Il lavoro di RSA è stato sostenuto da una sovvenzione della Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Gli autori desiderano riconoscere l’uso di Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |