Bu protokol, optik koherens tomografi kullanılarak murin koroidine melanomun implantasyonu ve değerlendirilmesini tanımlamaktadır.
Deneysel koroidal melanom modellerinin oluşturulması, tümörleri doğru lokalizasyonda indükleme yeteneği açısından zordur. Ek olarak, posterior koroidal melanomun in vivo olarak gözlemlenmesindeki zorluklar, tümör lokalizasyonunu ve büyüme değerlendirmesini gerçek zamanlı olarak sınırlar. Burada açıklanan yaklaşım, çok aşamalı bir alt koroidal B16LS9 hücre enjeksiyon prosedürü ile farelerde koroidal melanom oluşturmak için teknikleri optimize eder. Fare uveasının küçük boyutlarına enjeksiyonda hassasiyet sağlamak için, tüm prosedür mikroskop altında gerçekleştirilir. İlk olarak, gözün dorsal-temporal bölgesinde konjonktival bir peritomi oluşur. Daha sonra, maruz kalan skleradan bir iğne sokularak alt koroidal boşluğa bir yol oluşturulur. Bunu künt bir iğnenin kanala sokulması ve melanom hücrelerinin koroide enjekte edilmesi izler. Enjeksiyondan hemen sonra, tümörün lokalizasyonunu ve ilerlemesini belirlemek için noninvaziv optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme kullanılır. Retina dekolmanı, tümör yeri ve boyutunun belirleyicisi olarak değerlendirilir. Sunulan yöntem, farelerde koroid lokalize melanomun tekrarlanabilir indüksiyonunu ve tümör büyüme değerlendirmesinin canlı görüntülenmesini sağlar. Bu nedenle, göz içi tümörleri incelemek için değerli bir araç sağlar.
Üveal melanom (UM) erişkinlerde en sık görülen göz içi primer malignitedir. Oküler melanomların yaklaşık% 90’ı üveal sistem1’in koroid bölgesindeki melanositlerden kaynaklanır. UM, morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir, çünkü hastaların% 50’sine yakınının metastatik hastalık geliştirdiği ve karaciğerin metastaz2’nin ana bölgesi olduğu tahmin edilmektedir. Primer lezyonların erken tedavisi metastaz olasılığını azaltabilir, ancak etkili bir tedavi metastaz oluşumunu engellemez3.
Üveal melanomun standart tedavisi, optik nöropati, retinopati, kuru göz sendromu ve katarakt nedeniyle görme kaybı ile ilişkili ışınlama tedavisini içerir. Cerrahi rezeksiyon tipik olarak lezyonun büyümesi tanınana ve karakterize edilene kadar ertelenir. Bununla birlikte, böyle bir gecikme metastatik hastalık gelişimine izin verebilir4. Bazı durumlarda, boşuna enükleasyon gereklidir. Tabii ki, bu radikal prosedür vizyonu tehlikeye atar ve dramatik estetik bozulmaya neden olur.
Üveal melanomu incelemek için deneysel modeller geliştirmeye adanmış birçok çaba gösterilmiştir. Bu malignitenin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan preklinik hayvan modelleri, üveal melanom için yeni tanı ve tedavi stratejilerinin araştırılmasında anahtardır. Oküler melanomun deneysel hayvan modelleri esas olarak farelerde, sıçanlarda ve tavşanlarda tümör hücrelerinin aşılanmasına dayanmaktadır 5,6. Fare modelleri uygun maliyetlidir ve hızlı üreme hızları ve insanlara yüksek genom benzerlikleri nedeniyle melanom çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Murin kutanöz melanom hücre hattı B16, C57BL6 farelerini aşılamak ve sinjenik tümörleri indüklemek için yaygın olarak kullanılır. Üveal melanomu indüklemek için bu modeli kullanırken, tümör taşıyan gözlerin tipik olarak aşılamadan 7-14 gün sonra enükleasyona tabi tutulması gerekir. Ayrıca, B16 oldukça invaziv bir modeldir. Gözün bağışıklık ayrıcalıklı doğası metastazı destekler ve metastazlar tipik olarak tümör hücresi aşılamasından 3-4 hafta sonra tespit edilebilir. Orijinal B16 çizgisinin alt kültürleri farklı metastatik özellikler gösterir6. Örneğin, Queens melanom hattı yüksek bir metastatik orana sahiptir 7,8. B16LS9 hücre hattı dendritik hücre morfolojisine sahiptir ve ebeveyn kutanöz melanom hattı B16F19 ile enjekte edilen C57BL / 6 farelerin karaciğer metastazlarından türetilmiştir. Gözün arka bölmesine enjekte edildiğinde, bu hücrelerin histolojik olarak insan üveal melanomuna benzeyen ve C57BL / 6’da karaciğere özgü metastazlar oluşturan, ancak Balb / C’de değil, fareler10,11,12’de karaciğere özgü metastazlar oluşturan göz içi tümörler oluşturduğu gösterilmiştir. Genetik olarak, hücreler, hepatosit büyüme faktörü13 için hücresel bir reseptör görevi gören c-met proto-onkogeninin daha yüksek ekspresyonu ile karakterize edilir. Buna karşılık, ebeveyn B16’nın 10. geçişi olan B16F10, göz içinden aşılandığında öncelikle akciğerlere metastaz yapar14. Hem B16F10 hem de B16LS9 pigmentlidir12.
Bazı önemli zorluklar murin üveal melanom modellerinin başarısını sınırlamaktadır. İlk olarak, tümör hücresi reflüsü ekstraoküler veya subkonjonktival melanoma yol açabilir. İkincisi, melanom hücrelerinin göz içi aşılamasından sonra tümör büyümesi genellikle oldukça değişkendir ve tedavi ve ilerlemeyi değerlendirmede zorluklar doğurur. Bir diğer önemli zorluk, tümör büyümesini in vivo olarak takip etme yeteneğinin sınırlı olmasıdır. Lusiferaz eksprese eden tümörler gibi biyolüminesan görüntüleme, oküler tümör büyümesini izlemek için yaygın olarak kullanılır15,16, tümörün göz içi yerleşimi hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, tümörün değerlendirilmesi tipik olarak gözün enükleasyonunu takiben yapılır10,17. Bu, tümör progresyonunu ve tedavilere yanıtı kapsamlı bir şekilde karakterize etme yeteneğini büyük ölçüde sınırlar. Üveal melanomun incelenmesindeki bir diğer önemli engel, pigmentli farelerde lezyonların izlenmesindeki zorluktur. Bu zorlukların üstesinden gelen yeni yaklaşımlar, hayvan modellerinde üveal melanom araştırmalarını teşvik etmek için gereklidir.
Optik koherens tomografi (OCT), gözün farklı bölümlerine yüksek çözünürlükte derinlemesine görüntü vermek için ayırt edici yetenekler sağlar, bu da ultrason18,19 dahil olmak üzere diğer metodolojilerle benzersizdir. OCT görüntüleme, çeşitli oküler hastalıkları incelemek için hayvan modellerinde kullanılmıştır20. Son zamanlarda, OKT görüntülemenin göz içi tümör büyümesini değerlendirmek için noninvaziv bir araç olduğu gösterilmiştir21. Burada tarif edilen protokol, melanom hücrelerinin murin koroidine implantasyonunu ve hücre aşılaması sırasında göz içi tümör lokalizasyonunu ve boyutunu tahmin etmek için OCT’nin kullanımını göstermektedir.
Üveal melanom, yeni terapötik yaklaşımlara büyük ihtiyaç duyulan yıkıcı bir hastalıktır. Bununla birlikte, üveal melanom ve potansiyel tedaviler üzerine yapılan araştırmalar, üveal melanom hayvan modellerinin teknik zorlukları ile sınırlıdır 1,25. Kanser hücrelerinin göz içi enjeksiyonu ile indüklenen oküler tümörler, muhtemelen fare gözünün küçük boyutları nedeniyle, hem lokalizasyon hem de boyut bakımından oldukça değiş…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen Arie Marcovich için İsrail’deki İsrail Bilim Vakfı’ndan (ISF) 1304/20 hibe ile desteklenmiştir. Histoloji analizi için İsrail, Rehovot, Kaplan Tıp Merkezi, Patoloji Bölümü’nden Shahar Ish-Shalom ve Ady Yosipovich’e teşekkür ederiz.
10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
C57BL/6 female mice | Envigo | ||
Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
HEPES | satorius | 03-025-1B | |
Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |