Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie
Summary
Het huidige protocol beschrijft de implantatie en evaluatie van melanoom in het muriene vaatvlies met behulp van optische coherentietomografie.
Abstract
Het opzetten van experimentele choroïdale melanoommodellen is een uitdaging in termen van het vermogen om tumoren op de juiste lokalisatie te induceren. Bovendien beperken moeilijkheden bij het observeren van posterieure choroïdale melanoom in vivo de tumorlocatie en groei-evaluatie in realtime. De hier beschreven aanpak optimaliseert technieken voor het vaststellen van choroïdaal melanoom bij muizen via een meerstaps subchoroïdale B16LS9-celinjectieprocedure. Om precisie mogelijk te maken bij het injecteren in de kleine afmetingen van de muis uvea, wordt de volledige procedure uitgevoerd onder een microscoop. Eerst wordt een conjunctivale peritomie gevormd in het dorsale-temporale gebied van het oog. Vervolgens wordt een kanaal in de subchoroïdale ruimte gecreëerd door een naald door de blootgestelde sclera te steken. Dit wordt gevolgd door het inbrengen van een stompe naald in het kanaal en de injectie van melanoomcellen in het vaatvlies. Onmiddellijk na injectie wordt niet-invasieve optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming gebruikt om de locatie en voortgang van de tumor te bepalen. Retinale loslating wordt geëvalueerd als een voorspeller van tumorplaats en -grootte. De gepresenteerde methode maakt de reproduceerbare inductie van vaatvlies-gelokaliseerd melanoom bij muizen en de live beeldvorming van tumorgroei-evaluatie mogelijk. Als zodanig biedt het een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van intraoculaire tumoren.
Introduction
Uveaal melanoom (UM) is de meest voorkomende intraoculaire primaire maligniteit bij volwassenen. Ongeveer 90% van de oculaire melanomen is afkomstig van melanocyten in het vaatvliesgebied van het uveale kanaal1. UM is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit, omdat naar schatting bijna 50% van de patiënten gemetastaseerde ziekte ontwikkelt, waarbij de lever de belangrijkste plaats van metastase is2. Vroege behandeling van primaire laesies kan de kans op metastasen verminderen, maar geen enkele effectieve behandeling voorkomt de vorming van metastasen3.
De standaardbehandeling van uveaal melanoom omvat bestralingstherapie, die gepaard gaat met verlies van gezichtsvermogen als gevolg van optische neuropathie, retinopathie, droge ogen syndroom en cataract. Chirurgische resectie wordt meestal uitgesteld totdat de groei van de laesie wordt herkend en gekarakteriseerd. Een dergelijke vertraging kan echter de ontwikkeling van gemetastaseerde ziekten mogelijkmaken 4. In sommige gevallen is nutteloze enucleatie vereist. Natuurlijk brengt deze radicale procedure het gezichtsvermogen in gevaar en resulteert het in dramatische esthetische achteruitgang.
Er zijn veel inspanningen geleverd aan het ontwikkelen van experimentele modellen om uveaal melanoom te bestuderen. Preklinische diermodellen die een nauwkeurige beoordeling van deze maligniteit mogelijk maken, zijn essentieel voor het onderzoeken van nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën voor uveaal melanoom. Experimentele diermodellen van oculair melanoom zijn voornamelijk gebaseerd op de inenting van tumorcellen bij muizen, ratten en konijnen 5,6. Muismodellen zijn kosteneffectief en worden veel gebruikt voor melanoomstudies vanwege hun snelle reproductiesnelheid en hoge genoomgelijkenis met mensen. De murine cutane melanoom cellijn B16 wordt vaak gebruikt om C57BL6-muizen te enten en syngenetische tumoren te induceren. Bij gebruik van dit model om uveaal melanoom te induceren, moeten tumordragende ogen meestal 7-14 dagen na inenting worden geënucleeerd. Verder is B16 een zeer invasief model. De immuunbevoorrechte aard van het oog ondersteunt metastase en metastasen kunnen meestal 3-4 weken na inenting van tumorcellen worden gedetecteerd. Subculturen van de oorspronkelijke B16-lijn vertonen verschillende metastatische eigenschappen6. De Queens melanoomlijn heeft bijvoorbeeld een hoge metastatische snelheidvan 7,8. De B16LS9-cellijn heeft dendritische celmorfologie en is afgeleid van levermetastasen van C57BL / 6-muizen geïnjecteerd met de ouderlijke cutane melanoomlijn B16F19. Wanneer ze in het achterste compartiment van het oog worden geïnjecteerd, bleken deze cellen intraoculaire tumoren te vormen, die histologisch lijken op menselijk uveaal melanoom en leverspecifieke metastasen vormen in C57BL / 6, maar niet Balb / C, muizen10,11,12. Genetisch worden de cellen gekenmerkt door een hogere expressie van het c-met proto-oncogen, dat fungeert als een cellulaire receptor voor hepatocytengroeifactor13. B16F10, de10e passage van de ouderlijke B16, daarentegen metastaseert voornamelijk naar de longen wanneer intraoculair14. Zowel B16F10 als B16LS9 zijn gepigmenteerd12.
Verschillende belangrijke uitdagingen beperken het succes van murine uveale melanoommodellen. Ten eerste kan tumorcelreflux leiden tot extraoculair of subconjunctivaal melanoom. Ten tweede is de tumorgroei na intraoculaire inenting van melanoomcellen vaak zeer variabel, wat problemen oplevert bij het evalueren van de behandeling en voortgang. Een andere grote moeilijkheid is het beperkte vermogen om tumorgroei in vivo te volgen. Hoewel bioluminescente beeldvorming, zoals van luciferase tot expressie brengende tumoren, vaak wordt gebruikt om de groei van oculaire tumorente controleren 15,16, kan het geen informatie geven over de intraoculaire locatie van de tumor. Daarom wordt de evaluatie van de tumor meestal uitgevoerd na enucleatie van het oog10,17. Dit beperkt het vermogen om tumorprogressie en respons op behandelingen uitgebreid te karakteriseren aanzienlijk. Een andere belangrijke hindernis bij het bestuderen van uveaal melanoom is de moeilijkheid om laesies bij gepigmenteerde muizen te volgen. Nieuwe benaderingen, die deze moeilijkheden overwinnen, zijn nodig om het onderzoek naar uveaal melanoom in diermodellen te bevorderen.
Optische coherentietomografie (OCT) biedt onderscheidende mogelijkheden om diep in de verschillende delen van het oog in hoge resolutie te beelden, wat ongeëvenaard is door andere methoden, waaronder echografie18,19. OCT-beeldvorming is gebruikt in diermodellen om verschillende oogziekten te bestuderen20. Onlangs werd OCT-beeldvorming aangetoond als niet-invasief middel om intraoculaire tumorgroei te evalueren21. Het hier beschreven protocol toont de implantatie van melanoomcellen in het muriene vaatvlies en het gebruik van OCT om intraoculaire tumorlokalisatie en -grootte te voorspellen op het moment van celinenting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uveaal melanoom is een verwoestende ziekte waarvoor nieuwe therapeutische benaderingen hard nodig zijn. Onderzoek naar uveaal melanoom en mogelijke behandelingen wordt echter beperkt door de technische uitdagingen van uveaal melanoom diermodellen 1,25. Oculaire tumoren, die worden geïnduceerd door intraoculaire injectie van kankercellen, zijn zeer variabel in zowel lokalisatie als grootte, waarschijnlijk vanwege de kleine afmetingen van het muizenoog. Een dergel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidie 1304/20 van de Israel Science Foundation (ISF), Israël, voor Arie Marcovich. We danken Shahar Ish-Shalom en Ady Yosipovich, van de afdeling Pathologie, Kaplan Medical Center, Rehovot, Israël, voor histologische analyse.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
- Jager, M. J., et al. Uveal melanoma. Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).
- Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. 71, 65-85 (2021).
- Damato, B. Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).
- Jouhi, S., et al. The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group. American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).
- Cao, J., Jager, M. J. Animal eye models for uveal melanoma. Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).
- Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. Animal models of uveal melanoma. Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).
- Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).
- Yang, H., Grossniklaus, H. E. Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model. Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).
- Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. Murine models of liver metastasis. Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).
- Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC). Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).
- Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. Murine models of liver metastasis. Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).
- Ashur-Fabian, O., et al. Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model. Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).
- Elia, G., et al. Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells. Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).
- Harning, R., Szalay, Z. Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Notting, I. C., et al. Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).
- Yang, H., et al. In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases. Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).
- Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases. Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. Phenotyping of mouse models with OCT. Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).
- Zaks, O., et al. In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma. Experimental Eye Research. 204, 108431 (2021).
- Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).
- Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. . Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition. , (2021).
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264 (2020).
- Chen, R., et al. Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes. Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).
- Yu, Q., et al. Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging. Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).
