Implantation et évaluation du mélanome dans la choroïde murine par tomographie par cohérence optique
Summary
Le présent protocole décrit l’implantation et l’évaluation du mélanome dans la choroïde murine à l’aide de la tomographie par cohérence optique.
Abstract
L’établissement de modèles expérimentaux de mélanome choroïdien est difficile en termes de capacité à induire des tumeurs à la localisation correcte. De plus, les difficultés à observer le mélanome choroïdien postérieur in vivo limitent l’emplacement de la tumeur et l’évaluation de la croissance en temps réel. L’approche décrite ici optimise les techniques d’établissement du mélanome choroïdien chez la souris via une procédure d’injection de cellules sous-choroïdiennes B16LS9 en plusieurs étapes. Pour permettre une injection précise dans les petites dimensions de l’uvée de la souris, la procédure complète est réalisée au microscope. Tout d’abord, une péritomie conjonctivale se forme dans la région dorso-temporale de l’œil. Ensuite, un tractus dans l’espace sous-choroïdien est créé en insérant une aiguille à travers la sclérotique exposée. Ceci est suivi par l’insertion d’une aiguille émoussée dans le tractus et l’injection de cellules de mélanome dans la choroïde. Immédiatement après l’injection, l’imagerie non invasive par tomographie par cohérence optique (OCT) est utilisée pour déterminer l’emplacement et la progression de la tumeur. Le décollement de la rétine est évalué comme un prédicteur du site et de la taille de la tumeur. La méthode présentée permet l’induction reproductible du mélanome localisé choroïde chez la souris et l’imagerie en direct de l’évaluation de la croissance tumorale. En tant que tel, il fournit un outil précieux pour l’étude des tumeurs intraoculaires.
Introduction
Le mélanome uvéal (UM) est la tumeur maligne primitive intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Environ 90 % des mélanomes oculaires proviennent de mélanocytes de la région choroïde du tractus uvéal1. L’UM est une cause majeure de morbidité et de mortalité, car on estime que près de 50% des patients développent une maladie métastatique, le foie étant le principal site de métastases2. Un traitement précoce des lésions primaires peut réduire le risque de métastases, mais aucun traitement efficace n’empêche la formation de métastases3.
Le traitement standard du mélanome uvéal comprend l’irradiation, qui est associée à une perte de vision due à la neuropathie optique, à la rétinopathie, au syndrome de l’œil sec et à la cataracte. La résection chirurgicale est généralement retardée jusqu’à ce que la croissance de la lésion soit reconnue et caractérisée. Cependant, un tel délai peut permettre le développement d’une maladie métastatique4. Dans certains cas, une énucléation futile est nécessaire. Bien sûr, cette procédure radicale compromet la vision et entraîne une détérioration esthétique dramatique.
De nombreux efforts ont été consacrés au développement de modèles expérimentaux pour étudier le mélanome uvéal. Les modèles animaux précliniques qui permettent une évaluation précise de cette malignité sont essentiels pour étudier de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour le mélanome uvéal. Les modèles animaux expérimentaux de mélanome oculaire sont principalement basés sur l’inoculation de cellules tumorales chez la souris, le rat et le lapin 5,6. Les modèles murins sont rentables et largement utilisés pour les études sur le mélanome en raison de leur taux de reproduction rapide et de leur grande similitude génomique avec les humains. La lignée cellulaire de mélanome cutané murin B16 est couramment utilisée pour inoculer des souris C57BL6 et induire des tumeurs syngéniques. Lors de l’utilisation de ce modèle pour induire un mélanome uvéal, les yeux porteurs de tumeurs doivent généralement être énucléés 7 à 14 jours après l’inoculation. De plus, la vitamine B16 est un modèle très invasif. La nature immuno-privilégiée de l’œil favorise les métastases, et les métastases peuvent généralement être détectées 3-4 semaines après l’inoculation des cellules tumorales. Les sous-cultures de la ligne B16 originale présentent des propriétés métastatiques distinctes6. Par exemple, la lignée du mélanome du Queens a un taux métastatique élevéde 7,8. La lignée cellulaire B16LS9 a une morphologie cellulaire dendritique et a été dérivée de métastases hépatiques de souris C57BL/6 injectées avec la lignée parentale de mélanome cutané B16F19. Lorsqu’elles ont été injectées dans le compartiment postérieur de l’œil, il a été démontré que ces cellules formaient des tumeurs intraoculaires, qui ressemblent histologiquement au mélanome uvéal humain et forment des métastases spécifiques au foie chez les souris C57BL / 6, mais pas Balb / C10,11,12. Génétiquement, les cellules sont caractérisées par une expression plus élevée du proto-oncogène c-met, qui agit comme un récepteur cellulaire du facteur de croissance des hépatocytes13. En revanche, B16F10, le 10epassage de la B16 parentale, métastase principalement aux poumons lorsqu’elle est inoculée par voie intraoculaire14. B16F10 et B16LS9 sont pigmentés12.
Plusieurs défis clés limitent le succès des modèles murins de mélanome uvéal. Tout d’abord, le reflux des cellules tumorales peut conduire à un mélanome extraoculaire ou sous-conjonctival. Deuxièmement, la croissance tumorale après inoculation intraoculaire des cellules de mélanome est souvent très variable, ce qui pose des difficultés dans l’évaluation du traitement et des progrès. Une autre difficulté majeure est la capacité limitée à suivre la croissance tumorale in vivo. Bien que l’imagerie bioluminescente, telle que celle des tumeurs exprimant la luciférase, soit couramment utilisée pour surveiller la croissance tumoraleoculaire 15,16, elle ne peut pas fournir d’informations sur l’emplacement intraoculaire de la tumeur. Par conséquent, l’évaluation de la tumeur est généralement réalisée après énucléation de l’œil10,17. Cela limite considérablement la capacité de caractériser la progression tumorale et la réponse aux traitements de manière approfondie. Un autre obstacle majeur dans l’étude du mélanome uvéal est la difficulté de surveiller les lésions chez les souris pigmentées. De nouvelles approches, qui surmontent ces difficultés, sont nécessaires pour promouvoir la recherche sur le mélanome uvéal dans les modèles animaux.
La tomographie par cohérence optique (TCO) offre des capacités distinctives pour imager profondément dans les différentes sections de l’œil en haute résolution, ce qui est inégalé par d’autres méthodologies, y compris l’échographie18,19. L’imagerie OCT a été utilisée dans des modèles animaux pour étudier diverses maladies oculaires20. Récemment, l’imagerie OCT a été démontrée comme moyen non invasif d’évaluer la croissance tumorale intraoculaire21. Le protocole décrit ici décrit l’implantation de cellules de mélanome dans la choroïde murine et l’utilisation de l’OCT pour prédire la localisation et la taille de la tumeur intraoculaire au moment de l’inoculation cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le mélanome uvéal est une maladie dévastatrice pour laquelle de nouvelles approches thérapeutiques sont grandement nécessaires. Cependant, la recherche sur le mélanome uvéal et les traitements potentiels est limitée par les défis techniques des modèles animaux de mélanome uvéal 1,25. Les tumeurs oculaires, qui sont induites par injection intraoculaire de cellules cancéreuses, sont très variables à la fois dans la localisation et la taille, probable…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en partie par la subvention 1304/20 de la Fondation israélienne pour la science (ISF), Israël, pour Arie Marcovich. Nous remercions Shahar Ish-Shalom et Ady Yosipovich, du département de pathologie du Kaplan Medical Center, Rehovot, Israël, pour l’analyse histologique.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
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