Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica
Summary
O presente protocolo descreve o implante e a avaliação do melanoma em coroide murina utilizando tomografia de coerência óptica.
Abstract
O estabelecimento de modelos experimentais de melanoma de coroide é um desafio em termos da capacidade de induzir tumores na localização correta. Além disso, as dificuldades na observação in vivo do melanoma de coroide posterior limitam a localização do tumor e a avaliação do crescimento em tempo real. A abordagem aqui descrita otimiza as técnicas para o estabelecimento do melanoma de coroide em camundongos por meio de um procedimento de injeção de células B16LS9 subcoroidal em várias etapas. Para permitir a precisão na injeção nas pequenas dimensões da úvea do rato, o procedimento completo é realizado sob um microscópio. Primeiro, uma peritomia conjuntival é formada na área dorso-temporal do olho. Em seguida, um trato no espaço subcoroidal é criado inserindo uma agulha através da esclera exposta. Isto é seguido pela inserção de uma agulha romba no trato e a injeção de células de melanoma na coroide. Imediatamente após a injeção, a tomografia de coerência óptica (OCT) não invasiva é utilizada para determinar a localização e a evolução do tumor. O descolamento de retina é avaliado como preditor da localização e tamanho do tumor. O método apresentado permite a indução reprodutível de melanoma localizado em coroide em camundongos e a avaliação do crescimento tumoral em imagens ao vivo. Como tal, fornece uma ferramenta valiosa para o estudo de tumores intraoculares.
Introduction
O melanoma uveal (UMT) é a neoplasia maligna primária intraocular mais frequente em adultos. Aproximadamente 90% dos melanomas oculares originam-se de melanócitos da região coroide do trato uveal1. A UMTT é uma importante causa de morbidade e mortalidade, pois estima-se que cerca de 50% dos pacientes desenvolvam doença metastática, sendo o fígado o principal sítio de metástase2. O tratamento precoce das lesões primárias pode reduzir a chance de metástases, porém nenhum tratamento efetivo previne a formação de metástases3.
O tratamento padrão do melanoma uveal inclui terapia de irradiação, que está associada à perda da visão devido à neuropatia óptica, retinopatia, síndrome do olho seco e catarata. A ressecção cirúrgica é tipicamente retardada até que o crescimento da lesão seja reconhecido e caracterizado. No entanto, esse atraso pode permitir o desenvolvimento de doençametastática4. Em alguns casos, a enucleação fútil é necessária. É claro que esse procedimento radical compromete a visão e resulta em dramática deterioração estética.
Muitos esforços têm sido dedicados ao desenvolvimento de modelos experimentais para o estudo do melanoma uveal. Modelos animais pré-clínicos que permitam a avaliação precisa dessa malignidade são fundamentais para a investigação de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o melanoma uveal. Modelos animais experimentais de melanoma ocular baseiam-se principalmente na inoculação de células tumorais em camundongos, ratos ecoelhos5,6. Modelos em camundongos são custo-efetivos e amplamente utilizados para estudos de melanoma devido à sua rápida taxa de reprodução e alta similaridade genômica com humanos. A linhagem celular de melanoma cutâneo murino B16 é comumente utilizada para inocular camundongos C57BL6 e induzir tumores singênicos. Ao usar esse modelo para induzir melanoma uveal, os olhos portadores de tumor normalmente precisam ser enucleados 7-14 dias após a inoculação. Além disso, o B16 é um modelo altamente invasivo. A natureza imunoprivilegiada do olho suporta metástases, e as metástases podem tipicamente ser detectadas 3-4 semanas após a inoculação de células tumorais. Subculturas da linhagem B16 original exibem propriedades metastáticas distintas6. Por exemplo, a linhagem de melanoma de Queens tem alta taxa de metástase7,8. A linhagem celular B16LS9 possui morfologia de células dendríticas e foi derivada de metástases hepáticas de camundongos C57BL/6 injetados com a linhagem de melanoma cutâneo parental B16F19. Quando injetadas no compartimento posterior do olho, essas células formaram tumores intraoculares, que histologicamente se assemelham ao melanoma uveal humano e formam metástases hepatoespecíficas em camundongos C57BL/6, mas não Balb/C10,11,12. Geneticamente, as células são caracterizadas por maior expressão do proto-oncogene c-met, que atua como receptor celular para o fator de crescimento de hepatócitos13. Em contraste, o B16F10, a10ª passagem do B16 parental, metastatiza primariamente para os pulmões quando inoculado intraocularmente14. Tanto o B16F10 quanto o B16LS9 são pigmentados12.
Vários desafios-chave limitam o sucesso de modelos de melanoma uveal murino. Primeiro, o refluxo de células tumorais pode levar a melanoma extraocular ou subconjuntival. Em segundo lugar, o crescimento tumoral após a inoculação intraocular de células de melanoma é frequentemente muito variável, dificultando a avaliação do tratamento e da evolução. Outra grande dificuldade é a capacidade limitada de acompanhar o crescimento tumoral in vivo. Embora imagens bioluminescentes, como a luciferase expressando tumores, sejam comumente usadas para monitorar o crescimento ocular do tumor15,16, elas não podem fornecer informações sobre a localização intraocular do tumor. Portanto, a avaliação do tumor é tipicamente realizada após a enucleação doolho10,17. Isso limita muito a capacidade de caracterizar a progressão tumoral e a resposta aos tratamentos extensivamente. Outro grande obstáculo no estudo do melanoma uveal é a dificuldade de monitoramento de lesões em camundongos pigmentados. Novas abordagens, que superem essas dificuldades, são necessárias para promover a pesquisa do melanoma uveal em modelos animais.
A tomografia de coerência óptica (OCT) fornece capacidades distintas para obter imagens profundas nas diferentes seções do olho em alta resolução, o que é incomparável com outras metodologias, incluindo a ultrassonografia18,19. A OCT tem sido utilizada em modelos animais para o estudo de diversas doenças oculares20. Recentemente, a OCT foi demonstrada como meio não invasivo para avaliar o crescimento tumoralintraocular21. O protocolo aqui descrito descreve a implantação de células de melanoma na coroide murina e o uso da OCT para predizer a localização e o tamanho do tumor intraocular no momento da inoculação celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O melanoma uveal é uma doença devastadora para a qual novas abordagens terapêuticas são extremamente necessárias. No entanto, a pesquisa sobre melanoma uveal e potenciais tratamentos é limitada pelos desafios técnicos dos modelos animais de melanoma uveal 1,25. Os tumores oculares, que são induzidos pela injeção intraocular de células cancerosas, são altamente variáveis em localização e tamanho, provavelmente devido às pequenas dimensões do olho …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi parcialmente financiado pelo subsídio 1304/20 da Israel Science Foundation (ISF), Israel, para Arie Marcovich. Agradecemos a Shahar Ish-Shalom e Ady Yosipovich, do Departamento de Patologia do Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel, pela análise histológica.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
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