Implantation und Beurteilung des Melanoms in der Aderhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Implantation und Beurteilung des Melanoms in der murinen Aderhaut mittels optischer Kohärenztomographie.
Abstract
Die Etablierung experimenteller Aderhautmelanommodelle ist eine Herausforderung in Bezug auf die Fähigkeit, Tumore an der richtigen Lokalisation zu induzieren. Darüber hinaus schränken Schwierigkeiten bei der Beobachtung des Melanoms der hinteren Aderhaut in vivo die Tumorlokalisation und die Wachstumsbewertung in Echtzeit ein. Der hier beschriebene Ansatz optimiert Techniken zur Etablierung eines Aderhautmelanoms bei Mäusen durch ein mehrstufiges subchoroidales B16LS9-Zellinjektionsverfahren. Um eine präzise Injektion in die kleinen Abmessungen der Maus zu ermöglichen, wird der gesamte Eingriff unter dem Mikroskop durchgeführt. Zunächst wird eine konjunktivale Peritomie im dorsal-temporalen Bereich des Auges gebildet. Dann wird ein Trakt in den subchoroidalen Raum geschaffen, indem eine Nadel durch die freiliegende Lederhaut eingeführt wird. Es folgt das Einstechen einer stumpfen Nadel in den Trakt und die Injektion von Melanomzellen in die Aderhaut. Unmittelbar nach der Injektion wird eine nichtinvasive optische Kohärenztomografie (OCT) eingesetzt, um die Lokalisation und das Fortschreiten des Tumors zu bestimmen. Die Netzhautablösung wird als Prädiktor für die Lokalisation und Größe des Tumors ausgewertet. Die vorgestellte Methode ermöglicht die reproduzierbare Induktion von Aderhaut-lokalisierten Melanomen bei Mäusen und die Live-Bildgebung der Tumorwachstumsauswertung. Als solches bietet es ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von intraokularen Tumoren.
Introduction
Das Uvealmelanom (UM) ist die häufigste intraokulare primäre Malignität bei Erwachsenen. Etwa 90 % der okulären Melanome stammen von Melanozyten in der Aderhautregion des Adergangs1. UM ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität, da schätzungsweise fast 50 % der Patienten eine metastasierende Erkrankung entwickeln, wobei die Leber der Hauptort der Metastasierungist 2. Eine frühzeitige Behandlung von primären Läsionen kann die Wahrscheinlichkeit von Metastasen verringern, aber keine wirksame Behandlung verhindert die Bildung von Metastasen3.
Die Standardbehandlung des Aderhautmelanoms umfasst die Strahlentherapie, die mit dem Verlust des Sehvermögens aufgrund von Optikusneuropathie, Retinopathie, Syndrom des trockenen Auges und Katarakt verbunden ist. Die chirurgische Resektion wird in der Regel verzögert, bis das Wachstum der Läsion erkannt und charakterisiert ist. Eine solche Verzögerung kann jedoch die Entwicklung von Metastasen ermöglichen4. In einigen Fällen ist eine vergebliche Enukleation erforderlich. Natürlich beeinträchtigt dieser radikale Eingriff das Sehvermögen und führt zu einer dramatischen ästhetischen Verschlechterung.
Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um experimentelle Modelle zur Untersuchung des Aderhautmelanoms zu entwickeln. Präklinische Tiermodelle, die eine genaue Beurteilung dieser Malignität ermöglichen, sind der Schlüssel zur Erforschung neuer diagnostischer und therapeutischer Strategien für das Aderhautmelanom. Experimentelle Tiermodelle des okulären Melanoms basieren hauptsächlich auf der Inokulation von Tumorzellen bei Mäusen, Ratten und Kaninchen 5,6. Mausmodelle sind kostengünstig und werden aufgrund ihrer schnellen Reproduktionsrate und der hohen Genomähnlichkeit zum Menschen häufig für Melanomstudien verwendet. Die murine kutane Melanomzelllinie B16 wird häufig zur Inokulation von C57BL6-Mäusen und zur Induktion syngener Tumore verwendet. Bei Verwendung dieses Modells zur Induktion eines Aderhautmelanoms müssen tumortragende Augen in der Regel 7-14 Tage nach der Inokulation enukleiert werden. Darüber hinaus ist B16 ein hochinvasives Modell. Die immunprivilegierte Natur des Auges begünstigt die Metastasierung, und Metastasen können in der Regel 3-4 Wochen nach der Inokulation der Tumorzellen entdeckt werden. Subkulturen der ursprünglichen B16-Linie weisen ausgeprägte metastatische Eigenschaftenauf 6. Zum Beispiel hat die Queens-Melanomlinie eine hohe Metastasierungsratevon 7,8. Die B16LS9-Zelllinie weist eine dendritische Zellmorphologie auf und wurde aus Lebermetastasen von C57BL/6-Mäusen gewonnen, denen die elterliche kutane Melanomlinie B16F19 injiziert wurde. Bei der Injektion in das hintere Kompartiment des Auges bildeten diese Zellen intraokulare Tumore, die histologisch dem humanen Aderhautmelanom ähneln und leberspezifische Metastasen in C57BL/6, aber nicht in Balb/C, Mäusen bilden10,11,12. Genetisch sind die Zellen durch eine höhere Expression des c-met-Proto-Onkogens gekennzeichnet, das als zellulärer Rezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor13 fungiert. Im Gegensatz dazu metastasiert B16F10, die 10. Passage des elterlichen B16, bei intraokularer Inokulation hauptsächlich in die Lunge14. Sowohl B16F10 als auch B16LS9 sind pigmentiert12.
Mehrere zentrale Herausforderungen schränken den Erfolg von murinen Aderhautmelanommodellen ein. Erstens kann ein Tumorzellreflux zu einem extraokularen oder subkonjunktivalen Melanom führen. Zweitens ist das Tumorwachstum nach intraokularer Inokulation von Melanomzellen oft sehr variabel, was die Beurteilung der Behandlung und des Fortschritts erschwert. Eine weitere große Schwierigkeit ist die eingeschränkte Fähigkeit, das Tumorwachstum in vivo zu verfolgen. Während die biolumineszente Bildgebung, z. B. von Luciferase-exprimierenden Tumoren, häufig zur Überwachung des okulären Tumorwachstums verwendet wird15,16, kann sie keine Informationen über die intraokulare Lage des Tumors liefern. Daher wird die Beurteilung des Tumors in der Regel nach der Enukleation des Auges durchgeführt10,17. Dies schränkt die Fähigkeit, die Tumorprogression und das Ansprechen auf Behandlungen umfassend zu charakterisieren, stark ein. Eine weitere große Hürde bei der Untersuchung des Aderhautmelanoms ist die Schwierigkeit, Läsionen bei pigmentierten Mäusen zu überwachen. Neue Ansätze, die diese Schwierigkeiten überwinden, sind erforderlich, um die Erforschung des Aderhautmelanoms im Tiermodell voranzutreiben.
Die optische Kohärenztomographie (OCT) bietet einzigartige Möglichkeiten, in hoher Auflösung tief in die verschiedenen Bereiche des Auges einzudringen, was von anderen Methoden, einschließlich Ultraschall, nicht erreichtwird 18,19. Die OCT-Bildgebung wurde in Tiermodellen verwendet, um verschiedene Augenerkrankungen zu untersuchen20. Kürzlich wurde die OCT-Bildgebung als nicht-invasives Mittel zur Beurteilung des intraokularen Tumorwachstums demonstriert21. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Implantation von Melanomzellen in die murine Aderhaut und die Verwendung der OCT zur Vorhersage der intraokularen Tumorlokalisation und -größe zum Zeitpunkt der Zellinokulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Uvealmelanom ist eine verheerende Erkrankung, für die neue Therapieansätze dringend benötigt werden. Die Forschung zum Aderhautmelanom und zu möglichen Therapien ist jedoch durch die technischen Herausforderungen von Aderhautmelanom-Tiermodellen begrenzt 1,25. Augentumoren, die durch intraokulare Injektion von Krebszellen induziert werden, sind sowohl in ihrer Lokalisation als auch in ihrer Größe sehr variabel, was wahrscheinlich auf die geringen Abmess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil durch das Stipendium 1304/20 der Israel Science Foundation (ISF), Israel, für Arie Marcovich unterstützt. Wir danken Shahar Ish-Shalom und Ady Yosipovich von der Abteilung für Pathologie des Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel, für die histologische Analyse.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
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