通过光学相干断层扫描 在 小鼠脉络膜中植入和评估黑色素瘤
Summary
本协议描述了利用光学相干断层扫描在小鼠脉络膜中植入和评估黑色素瘤。
Abstract
建立实验性脉络膜黑色素瘤模型在正确定位诱导肿瘤的能力方面具有挑战性。此外， 在体内 观察后脉络膜黑色素瘤的困难限制了肿瘤的实时定位和生长评估。这里描述的方法优化了通过多步骤亚脉络膜B16LS9细胞注射 程序在 小鼠中建立脉络膜黑色素瘤的技术。为了能够精确地注射到小鼠葡萄膜的小尺寸中，在显微镜下进行完整的程序。首先，在眼睛的背颞区形成结膜围膜。然后，通过将针插入暴露的巩膜来创建进入脉络膜下空间的束。随后将钝针插入尿道并将黑色素瘤细胞注射到脉络膜中。注射后立即利用无创光学相干断层扫描（OCT）成像来确定肿瘤的位置和进展。视网膜脱离被评估为肿瘤部位和大小的预测指标。所提出的方法能够可重复地诱导小鼠脉络膜局部黑色素瘤和肿瘤生长评估的实时成像。因此，它为研究眼内肿瘤提供了有价值的工具。
Introduction
葡萄膜黑色素瘤 （UM） 是成人中最常见的眼内原发性恶性肿瘤。大约 90% 的眼部黑色素瘤起源于葡萄膜束脉络膜区域的黑色素细胞1。UM是发病和死亡的主要原因，因为据估计，近50%的患者发展为转移性疾病，肝脏是转移的主要部位2。原发性病变的早期治疗可能会减少转移的机会，但没有有效的治疗方法可以防止转移的形成3。
葡萄膜黑色素瘤的标准治疗包括放射治疗，该放射治疗与视神经病变、视网膜病变、干眼综合征和白内障导致的视力丧失有关。手术切除通常延迟到病变的生长被识别和表征。然而，这种延迟可能会使转移性疾病发展4。在某些情况下，需要徒劳的眼球摘除。当然，这种激进的程序会损害视力并导致美学急剧恶化。
已经有许多努力致力于开发研究葡萄膜黑色素瘤的实验模型。能够准确评估这种恶性肿瘤的临床前动物模型是研究葡萄膜黑色素瘤新诊断和治疗策略的关键。眼部黑色素瘤的实验动物模型主要基于小鼠、大鼠和兔5，6中肿瘤细胞的接种。小鼠模型具有成本效益，由于其快速的繁殖速度和与人类的高基因组相似性，广泛用于黑色素瘤研究。小鼠皮肤黑色素瘤细胞系B16通常用于接种C57BL6小鼠并诱导同系肿瘤。当使用该模型诱导葡萄膜黑色素瘤时，荷瘤的眼睛通常需要在接种后7-14天进行眼球摘除。此外，B16是一种高度侵入性的模型。眼睛的免疫特权性质支持转移，转移通常在肿瘤细胞接种后 3-4 周检测到。原始B16系的传代培养物显示出不同的转移特性6。例如，皇后区黑色素瘤系具有高转移率7，8。B16LS9细胞系具有树突状细胞形态，来源于注射亲本皮肤黑色素瘤系B16F19的C57BL / 6小鼠的肝转移。当注射到眼睛的后室时，这些细胞被显示形成眼内肿瘤，其组织学类似于人葡萄膜黑色素瘤，并在C57BL / 6中形成肝脏特异性转移，但不是Balb / C，小鼠10，11，12。在遗传学上，这些细胞的特征在于c-met原癌基因的更高表达，其作为肝细胞生长因子13的细胞受体。相比之下，B16F10是亲本B16的第10代，主要在眼内接种时转移到肺部14。B16F10和B16LS9都是色素12。
几个关键挑战限制了小鼠葡萄膜黑色素瘤模型的成功。首先，肿瘤细胞反流可能导致眼外或结膜下黑色素瘤。其次，黑色素瘤细胞眼内接种后的肿瘤生长通常变化很大，给评估治疗和进展带来了困难。另一个主要困难是跟踪体内肿瘤生长的能力有限。虽然生物发光成像，例如表达荧光素酶的肿瘤，通常用于监测眼部肿瘤的生长15，16，但它不能提供有关肿瘤眼内位置的信息。因此，肿瘤的评估通常在眼球摘除后进行10，17。这极大地限制了表征肿瘤进展和对治疗反应的能力。研究葡萄膜黑色素瘤的另一个主要障碍是难以监测色素小鼠的病变。需要克服这些困难的新方法来促进动物模型中葡萄膜黑色素瘤的研究。
光学相干断层扫描（OCT）提供了独特的功能，可以高分辨率深入眼睛的不同部分成像，这是其他方法（包括超声18，19）无法比拟的。OCT成像已在动物模型中用于研究各种眼部疾病20。最近，OCT成像被证明是评估眼内肿瘤生长的非侵入性手段21。这里描述的方案描述了黑色素瘤细胞在小鼠脉络膜中的植入以及利用OCT来预测细胞接种时的眼内肿瘤定位和大小。
Protocol
Representative Results
Discussion
葡萄膜黑色素瘤是一种毁灭性的疾病，非常需要新的治疗方法。然而，葡萄膜黑色素瘤和潜在治疗方法的研究受到葡萄膜黑色素瘤动物模型1，25的技术挑战的限制。由眼内注射癌细胞诱导的眼部肿瘤在定位和大小上变化很大，可能是由于小鼠眼睛的尺寸小。这种变异性是全面评估肿瘤进展的障碍。本文描述的实验方法允许人们基于实时OCT成像<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了以色列以色列科学基金会（ISF）为Arie Marcovich提供的1304/20赠款的部分支持。我们感谢来自以色列雷霍沃特卡普兰医疗中心病理学系的Shahar Ish-Shalom和Ady Yosipovich进行组织学分析。
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
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