Implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica
Summary
El presente protocolo describe la implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica.
Abstract
El establecimiento de modelos experimentales de melanoma coroideo es un desafío en términos de la capacidad de inducir tumores en la localización correcta. Además, las dificultades para observar el melanoma coroideo posterior in vivo limitan la localización del tumor y la evaluación del crecimiento en tiempo real. El enfoque descrito aquí optimiza las técnicas para establecer el melanoma coroideo en ratones a través de un procedimiento de inyección de células B16LS9 subcoroidea de varios pasos. Para permitir la precisión en la inyección en las pequeñas dimensiones de la úvea del ratón, el procedimiento completo se realiza bajo un microscopio. Primero, se forma una peritomía conjuntival en el área dorsal-temporal del ojo. Luego, se crea un tracto en el espacio subcoroideo insertando una aguja a través de la esclerótica expuesta. Esto es seguido por la inserción de una aguja roma en el tracto y la inyección de células de melanoma en la coroides. Inmediatamente después de la inyección, se utilizan imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) no invasivas para determinar la ubicación y el progreso del tumor. El desprendimiento de retina se evalúa como un predictor del sitio y tamaño del tumor. El método presentado permite la inducción reproducible de melanoma localizado en coroides en ratones y la obtención de imágenes en vivo de la evaluación del crecimiento tumoral. Como tal, proporciona una herramienta valiosa para estudiar los tumores intraoculares.
Introduction
El melanoma uveal (UM) es la neoplasia maligna primaria intraocular más frecuente en adultos. Aproximadamente el 90% de los melanomas oculares se originan a partir de melanocitos en la región coroidea del tracto uveal1. La UM es una causa importante de morbilidad y mortalidad, ya que se estima que cerca del 50% de los pacientes desarrollan enfermedad metastásica, siendo el hígado el sitio principal de metástasis2. El tratamiento temprano de las lesiones primarias puede reducir la posibilidad de metástasis, pero ningún tratamiento eficaz previene la formación de metástasis3.
El tratamiento estándar del melanoma uveal incluye la terapia de irradiación, que se asocia con pérdida de la visión debido a neuropatía óptica, retinopatía, síndrome del ojo seco y cataratas. La resección quirúrgica generalmente se retrasa hasta que se reconoce y caracteriza el crecimiento de la lesión. Sin embargo, tal retraso puede permitir el desarrollo de la enfermedad metastásica4. En algunos casos, se requiere una enucleación inútil. Por supuesto, este procedimiento radical compromete la visión y resulta en un deterioro estético dramático.
Se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo de modelos experimentales para estudiar el melanoma uveal. Los modelos animales preclínicos que permiten una evaluación precisa de esta neoplasia maligna son clave para investigar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas para el melanoma uveal. Los modelos animales experimentales de melanoma ocular se basan principalmente en la inoculación de células tumorales en ratones, ratas y conejos 5,6. Los modelos de ratón son rentables y ampliamente utilizados para estudios de melanoma debido a su rápida tasa de reproducción y alta similitud del genoma con los humanos. La línea celular de melanoma cutáneo murino B16 se utiliza comúnmente para inocular ratones C57BL6 e inducir tumores singénicos. Cuando se utiliza este modelo para inducir melanoma uveal, los ojos portadores de tumores generalmente necesitan ser enucleados 7-14 días después de la inoculación. Además, B16 es un modelo altamente invasivo. La naturaleza inmunoprivilegiada del ojo apoya la metástasis, y las metástasis generalmente se pueden detectar 3-4 semanas después de la inoculación de células tumorales. Los subcultivos de la línea B16 original muestran propiedades metastásicas distintas6. Por ejemplo, la línea de melanoma de Queens tiene una alta tasa metastásica 7,8. La línea celular B16LS9 tiene morfología de células dendríticas y se derivó de metástasis hepáticas de ratones C57BL/6 inyectados con la línea de melanoma cutáneo parental B16F19. Cuando se inyectaron en el compartimiento posterior del ojo, se demostró que estas células forman tumores intraoculares, que se asemejan histológicamente al melanoma uveal humano y forman metástasis específicas del hígado en ratones C57BL / 6, pero no en Balb / C, 10,11,12. Genéticamente, las células se caracterizan por una mayor expresión del protooncogén c-met, que actúa como receptor celular para el factor de crecimiento de hepatocitos13. En contraste, B16F10, eldécimo pasaje de la B16 parental, hace metástasis principalmente a los pulmones cuando se inocula intraocularmente14. Tanto B16F10 como B16LS9 están pigmentados12.
Varios desafíos clave limitan el éxito de los modelos murinos de melanoma uveal. En primer lugar, el reflujo de células tumorales puede conducir a melanoma extraocular o subconjuntival. En segundo lugar, el crecimiento tumoral después de la inoculación intraocular de células de melanoma es a menudo muy variable, lo que plantea dificultades para evaluar el tratamiento y el progreso. Otra dificultad importante es la capacidad limitada para seguir el crecimiento del tumor in vivo. Si bien las imágenes bioluminiscentes, como las de tumores que expresan luciferasa, se usan comúnmente para monitorear el crecimiento del tumor ocular15,16, no pueden proporcionar información sobre la ubicación intraocular del tumor. Por lo tanto, la evaluación del tumor se realiza típicamente después de la enucleación del ojo10,17. Esto limita en gran medida la capacidad de caracterizar ampliamente la progresión del tumor y la respuesta a los tratamientos. Otro obstáculo importante en el estudio del melanoma uveal es la dificultad para monitorear las lesiones en ratones pigmentados. Se requieren nuevos enfoques, que superen estas dificultades, para promover la investigación del melanoma uveal en modelos animales.
La tomografía de coherencia óptica (OCT) proporciona capacidades distintivas para obtener imágenes profundas en las diferentes secciones del ojo en alta resolución, lo que no tiene paralelo con otras metodologías, incluida la ecografía18,19. La imagen de OCT se ha utilizado en modelos animales para estudiar diversas enfermedades oculares20. Recientemente, la imagen de OCT fue demostrada como medio no invasivo para evaluar el crecimiento tumoral intraocular21. El protocolo descrito aquí describe la implantación de células de melanoma en la coroides murina y la utilización de OCT para predecir la localización y el tamaño del tumor intraocular en el momento de la inoculación celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El melanoma uveal es una enfermedad devastadora para la cual se necesitan nuevos enfoques terapéuticos. Sin embargo, la investigación sobre el melanoma uveal y los tratamientos potenciales está limitada por los desafíos técnicos de los modelos animales de melanoma uveal 1,25. Los tumores oculares, que son inducidos por la inyección intraocular de células cancerosas, son muy variables tanto en localización como en tamaño, probablemente debido a las peque?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado en parte por la subvención 1304/20 de la Fundación de Ciencia de Israel (ISF), Israel, para Arie Marcovich. Agradecemos a Shahar Ish-Shalom y Ady Yosipovich, del Departamento de Patología, Centro Médico Kaplan, Rehovot, Israel, por el análisis histológico.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
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