Evaluación de los efectos tóxicos asociados a las células T del receptor de antígeno quimérico mediante un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda
Summary
Aquí, describimos un protocolo en el que se utiliza un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar y monitorear las toxicidades asociadas a las células T del receptor de antígeno quimérico dirigido a CD19.
Abstract
La terapia con células del receptor de antígeno quimérico T (CART) se ha convertido en una herramienta poderosa para el tratamiento de múltiples tipos de neoplasias malignas CD19+ , lo que ha llevado a la reciente aprobación por parte de la FDA de varias terapias celulares CART dirigidas a CD19 (CART19). Sin embargo, la terapia con células CART se asocia con un conjunto único de toxicidades que conllevan su propia morbilidad y mortalidad. Esto incluye el síndrome de liberación de citocinas (CRS, por sus siglas en inglés) y la neuroinflamación (NI, por sus siglas en inglés). El uso de modelos preclínicos de ratón ha sido crucial en la investigación y el desarrollo de la tecnología CART para evaluar tanto la eficacia como la toxicidad de CART. Los modelos preclínicos disponibles para probar esta inmunoterapia celular adoptiva incluyen modelos singénicos, xenoinjertos, transgénicos y de ratón humanizado. No existe un modelo único que refleje a la perfección el sistema inmunológico humano, y cada modelo tiene fortalezas y debilidades. El objetivo de este artículo es describir un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes que utiliza blastocitos leucémicos de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar las toxicidades asociadas a CART19, CRS y NI. Se ha demostrado que este modelo recapitula las toxicidades asociadas a CART19, así como la eficacia terapéutica observada en la clínica.
Introduction
La terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CART) ha revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer. Ha demostrado ser exitoso en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refractaria, el linfoma de células B grandes, el linfoma de células del manto, el linfoma folicular y el mieloma múltiple 1,2,3,4,5,6,7, lo que ha llevado a las recientes aprobaciones de la FDA. A pesar del éxito inicial en los ensayos clínicos, el tratamiento con terapia celular CART produce toxicidades que a menudo son graves y, en ocasiones, letales. Las toxicidades más comunes después de la terapia con células CART incluyen el desarrollo de CRS y NI, también conocido como síndrome de neurotoxicidad asociado a células efectoras inmunitarias (ICANS)8,9. El CRS se debe a la sobreactivación y expansión masiva de las células CART in vivo, lo que conduce a la posterior secreción de múltiples citocinas inflamatorias, incluyendo interferón-γ, factor de necrosis tumoral-α, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Esto resulta en hipotensión, fiebres altas, síndrome de fuga capilar, insuficiencia respiratoria, falla multiorgánica y, en algunos casos, la muerte10,11. El SRC se desarrolla en el 50-100% de los casos después de la terapia celular CART1911,12,13. El ICANS es otro evento adverso único asociado a la terapia con células CART y se caracteriza por edema cerebral generalizado, confusión, obnubilación, afasia, debilidad motora y, ocasionalmente, convulsiones 9,14. Cualquier grado de ICANS ocurre en hasta el 70% de los pacientes, y los grados 3-4 se reportan en el 20-30% de los pacientes 5,10,15,16. En general, el SRI y el ICANS son comunes y pueden ser fatales.
El manejo de ICANS después de la terapia con células CART es un desafío. La mayoría de los pacientes con ICANS también experimentan CRS17, que a menudo se puede tratar con el antagonista del receptor de IL-6 tocilizumab o esteroides18. Un informe previo reveló que la intervención temprana con tocilizumab disminuyó la tasa de SRC grave, pero no afectó la incidencia ni la gravedad de la ICANS19. En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz ni un agente profiláctico para el ICANS, por lo que es crucial investigar estrategias preventivas20.
Se cree que las células mieloides y las citoquinas/quimiocinas asociadas son los principales impulsores del desarrollo del SRC y de la ICANS21. Mientras que el SRC está directamente relacionado con la elevación extrema de las citocinas y la expansión de las células T, la fisiopatología de las ICANS es en gran parte desconocida22,23. Por lo tanto, es imperativo establecer un modelo de ratón que recapitule estas toxicidades después de la terapia con células CART para estudiar los mecanismos y desarrollar estrategias preventivas.
En la actualidad existen múltiples modelos animales preclínicos que se utilizan para estudiar, optimizar y validar la eficacia de las células CART, así como para monitorizar sus toxicidades asociadas. Estos incluyen ratones singénicos, xenoinjertos, transgénicos inmunocompetentes, transgénicos humanizados y xenoinjertos derivados de pacientes, además de modelos de primates. Sin embargo, cada uno de estos modelos tiene inconvenientes, y algunos no reflejan la verdadera eficacia o seguridad de las células CART24,25. Por lo tanto, es imperativo elegir cuidadosamente el mejor modelo para los objetivos previstos del estudio.
El objetivo de este artículo es describir la metodología que se utiliza para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART, CRS y NI, utilizando un modelo in vivo de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) de LLA (Figura 1). En concreto, en los métodos aquí descritos, se utilizan células CART19 generadas en el laboratorio de los autores siguiendo los protocolos descritos anteriormente. En resumen, las células T humanas se aíslan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos mediante una técnica de gradiente de densidad, se estimulan con perlas CD3/CD28 en el día 0 y se transducen lentiviralmente en el día 1 con CAR compuestas por un fragmento variable de cadena única dirigido a CD19 fusionado con los dominios de señalización 4-1BB y CD3ζ. A continuación, estas células CART se expanden, se desgranan el día 6 y se criopreservan el día 8 26,27,28,29,30. Como se ha descrito anteriormente, los ratones se someten a un tratamiento de agotamiento linfológico, seguido de la administración de blastocitos leucémicos (LLA) derivados del paciente28. En primer lugar, el injerto tumoral se verifica mediante la extracción de sangre submandibular. Tras el establecimiento de una carga tumoral adecuada, se administran células CART19 a los ratones. Luego, los ratones se pesan diariamente para evaluar su bienestar. Se realiza una resonancia magnética nuclear (RMN) de animales pequeños para evaluar la NI, junto con el sangrado de la cola para evaluar la expansión de las células T y la producción de citocinas/quimiocinas. Se recomienda encarecidamente el uso de las técnicas que se describen a continuación como modelo para estudiar las toxicidades asociadas a las células CART en un modelo PDX.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe, se ha descrito una metodología para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART utilizando un modelo ALL PDX. Más específicamente, este modelo busca imitar dos toxicidades potencialmente mortales, CRS y NI, que los pacientes a menudo experimentan después de la infusión de células CART. Recapitula muchas características de las toxicidades de CART observadas en la clínica: pérdida de peso, disfunción motora, neuroinflamación, producción inflamatoria de citoquinas y quimiocinas, y la i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (R37CA266344, 1K99CA273304), el Departamento de Defensa (CA201127), la cartera K2R de Mayo Clinic (S.S.K.), el Centro de Medicina Personalizada de Mayo Clinic (S.S.K.) y la Fundación Predolin (R.L.S.). Además, nos gustaría agradecer al personal del Centro Central de RMN de Mayo Clinic. La Figura 1 fue creada en BioRender.com
Materials
| APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
| Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
| Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
| Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
| BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
| BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
| Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
| Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
| Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
| MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
| Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
| Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
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