כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מודל xenograft הנגזר מחולה לוקמיה לימפובלסטית חריפה משמש כאסטרטגיה להערכה וניטור רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי ממוקד CD19 תאי T.
טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CART) התגלה ככלי רב עוצמה לטיפול בסוגים רבים של ממאירויות CD19+ , מה שהוביל לאישור ה- FDA לאחרונה למספר טיפולים בתאי CART ממוקדי CD19 (CART19). עם זאת, טיפול בתאי CART קשור לקבוצה ייחודית של רעילות הנושאות תחלואה ותמותה משלהן. זה כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS) ודלקת עצבית (NI). השימוש במודלים פרה-קליניים של עכברים היה חיוני במחקר ובפיתוח של טכנולוגיית CART להערכת יעילות CART ורעילות CART. המודלים הפרה-קליניים הזמינים לבדיקת אימונותרפיה תאית מאמצת זו כוללים מודלים סינגניים, קסנוגרפט, טרנסגניים ואנושיים של עכברים. אין מודל אחד שמשקף בצורה חלקה את מערכת החיסון האנושית, ולכל מודל יש חוזקות וחולשות. מאמר שיטות זה נועד לתאר מודל xenograft נגזר המטופל באמצעות פיצוצים לוקמיים מחולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה כאסטרטגיה להערכת רעילות הקשורה CART19, CRS ו- NI. מודל זה הוכח כמחזיר רעילות הקשורה ל- CART19, כמו גם יעילות טיפולית כפי שניתן לראות במרפאה.
טיפול תאי בקולטן אנטיגן כימרי T (CART) חולל מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן. הוא הוכח כמוצלח בטיפול בלוקמיה לימפובלסטית חריפה חוזרת / עקשנית (ALL), לימפומה של תאי B גדולים, לימפומה של תאי מעטפת, לימפומה פוליקולרית ומיאלומה נפוצה 1,2,3,4,5,6,7, מה שהוביל לאישורי FDA אחרונים. למרות ההצלחה הראשונית בניסויים קליניים, הטיפול בתאי CART גורם לרעילות שהיא לעתים קרובות חמורה ולעיתים קטלנית. הרעלים הנפוצים ביותר לאחר טיפול בתאי CART כוללים התפתחות של CRS ו- NI, המכונה גם תסמונת נוירוטוקסיות הקשורה לתאי השפעה חיסוניים (ICANS)8,9. CRS נגרמת עקב פעילות יתר והתרחבות מסיבית של תאי CART in vivo, מה שמוביל להפרשה לאחר מכן של ציטוקינים דלקתיים מרובים, כולל אינטרפרון-γ, גורם נמק גידול-α, גרנולוציטים-מקרופאגים גורם מגרה מושבה (GM-CSF), ואינטרלוקין-6 (IL-6). התוצאה היא לחץ דם נמוך, חום גבוה, תסמונת דליפת נימים, כשל נשימתי, כשל רב איברי, ובמקרים מסוימים, מוות10,11. CRS מתפתח ב 50-100% מהמקרים לאחר טיפול תאי CART1911,12,13. ICANS הוא אירוע שלילי ייחודי נוסף הקשור לטיפול בתאי CART ומאופיין בצקת מוחית כללית, בלבול, אובטונדציה, אפזיה, חולשה מוטורית, ולעיתים התקפים 9,14. כל דרגה של ICANS מתרחשת בעד 70% מהחולים, וכיתות 3-4 מדווחות ב 20-30% מהחולים 5,10,15,16. באופן כללי, CRS ו-ICANS נפוצים ועלולים להיות קטלניים.
ניהול ICANS לאחר טיפול בתאי CART הוא מאתגר. רוב החולים עם ICANS חווים גם CRS17, אשר לעתים קרובות ניתן לטפל עם אנטגוניסט קולטן IL-6 tocilizumab או סטרואידים18. דו”ח קודם גילה כי התערבות מוקדמת עם tocilizumab הפחיתה את שיעור CRS חמור אך לא השפיעה על ההיארעות או החומרה של ICANS19. נכון לעכשיו, אין טיפול יעיל או סוכן מניעתי עבור ICANS, וזה חיוני לחקור אסטרטגיות מניעה20.
תאים מיאלואידים וציטוקינים/כימוקינים הקשורים אליהם נחשבים למניעים העיקריים להתפתחות CRS ו-ICANS21. בעוד CRS קשור ישירות לגובה קיצוני של ציטוקינים והתפשטות תאי T, הפתופיזיולוגיה של ICANS אינה ידועה במידה רבה22,23. לכן, זה הכרחי להקים מודל עכבר כי reapitulates אלה רעילות לאחר טיפול בתאי CART כדי ללמוד את המנגנונים ולפתח אסטרטגיות מניעה.
ישנם מודלים פרה-קליניים רבים של בעלי חיים המשמשים כיום למחקר, אופטימיזציה ואימות היעילות של תאי CART, כמו גם לניטור הרעילות הקשורה אליהם. אלה כוללים עכברים סינגניים, קסנוגרפט, טרנסגניים בעלי יכולת חיסון, עכברים טרנסגניים אנושיים ועכברי קסנוגרפט שמקורם במטופל, בנוסף למודלים של פרימטים. עם זאת, לכל אחד מהמודלים הללו יש חסרונות, וחלקם אינם משקפים את היעילות האמיתית או חששות הבטיחות של תאי CART24,25. לכן, חובה לבחור בקפידה את המודל הטוב ביותר למטרות המיועדות של המחקר.
מאמר זה מבקש לתאר את המתודולוגיה המשמשת להערכת רעילות הקשורה לתאי CART, CRS ו-NI, באמצעות מודל של קסנוגרפט (PDX) in vivo (PDX) שמקורו במטופל (איור 1). באופן ספציפי, בשיטות המתוארות כאן, תאי CART19 שנוצרו במעבדה של המחברים משמשים בעקבות פרוטוקולים שתוארו לעיל. בקצרה, תאי T אנושיים מבודדים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים בריאים של תורמים (PBMCs) באמצעות טכניקת שיפוע צפיפות, מגורים עם חרוזי CD3 / CD28 ביום 0, ומומרים באופן לנטיוויראלי ביום הראשון עם CARs המורכבים ממקטע משתנה שרשרת יחיד ממוקד CD19 המאוחה לתחומי איתות 4-1BB ו- CD3ζ. תאי CART אלה מורחבים לאחר מכן, מנוטרלים מחרוזים ביום 6, ונשמרים בהקפאה ביום 8 26,27,28,29,30. כפי שתואר קודם לכן, עכברים נתונים לטיפול בלימפודל, ואחריו מתן פיצוצים לוקמיים שמקורם במטופל (ALL)28. ראשית, השתלת הגידול מאומתת באמצעות איסוף דם submandibular. לאחר קביעת נטל גידול מתאים, תאי CART19 ניתנים לעכברים. לאחר מכן, העכברים נשקלים מדי יום כדי להעריך את רווחתם. הדמיית תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים (MRI) מבוצעת כדי להעריך NI, יחד עם דימום זנב כדי להעריך את התרחבות תאי T וייצור ציטוקינים/כימוקינים. מומלץ מאוד להשתמש בטכניקות המתוארות להלן כמודל לחקר רעילות הקשורה לתאי CART במודל PDX.
בדו”ח זה תוארה מתודולוגיה להערכת רעילות הקשורה לתאי CART באמצעות מודל ALL PDX. באופן ספציפי יותר, מודל זה מבקש לחקות שתי רעילויות מסכנות חיים, CRS ו- NI, שחולים חווים לעתים קרובות לאחר עירוי של תאי CART. הוא משחזר סימני היכר רבים של רעילות CART שנצפו במרפאה: ירידה במשקל, תפקוד מוטורי לקוי, דלקת עצבית, ייצ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה חלקית באמצעות המכונים הלאומיים לבריאות (R37CA266344, 1K99CA273304), משרד ההגנה (CA201127), צינור K2R של מאיו קליניק (S.S.K.), מרכז מאיו קליניק לרפואה אינדיבידואלית (S.S.K.), וקרן פרדולין (R.L.S). בנוסף, ברצוננו להודות לצוות מתקן הליבה NMR של מאיו קליניק. איור 1 נוצר בשנת BioRender.com
APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |