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Cancer Research

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

여기에서 우리는 급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식 모델이 CD19 표적 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성을 평가하고 모니터링하기 위한 전략으로 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 여러 유형의 CD19+ 악성 종양 치료를 위한 강력한 도구로 부상했으며, 이로 인해 최근 여러 CD19 표적 CART(CART19) 세포 요법에 대한 FDA 승인이 이루어졌습니다. 그러나 CART 세포 요법은 자체 이환율 및 사망률을 수반하는 고유한 독성 세트와 관련이 있습니다. 여기에는 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경염증(NI)이 포함됩니다. 전임상 마우스 모델의 사용은 CART 효능과 CART 독성을 모두 평가하기 위한 CART 기술의 연구 및 개발에 매우 중요했습니다. 이 입양 세포 면역 요법을 테스트하기 위해 사용 가능한 전임상 모델에는 동계, 이종 이식편, 형질전환 및 인간화 마우스 모델이 포함됩니다. 인간의 면역 체계를 매끄럽게 반영하는 단일 모델은 없으며 각 모델에는 강점과 약점이 있습니다. 이 방법 논문은 CART19 관련 독성, CRS 및 NI를 평가하기 위한 전략으로 급성 림프구성 백혈병 환자의 백혈병 모세포를 사용하여 환자 유래 이종이식 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 모델은 임상에서 볼 수 있는 CART19 관련 독성과 치료 효능을 요약하는 것으로 나타났습니다.

Introduction

키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 암 면역 요법 분야에 혁명을 일으켰습니다. 재발성/불응성 급성 림프구성 백혈병(ALL), 거대 B 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종 및 다발성 골수종 1,2,3,4,5,6,7 치료에 성공적인 것으로 입증되어 최근 FDA 승인을 받았습니다. 임상 시험의 초기 성공에도 불구하고 CART 세포 요법으로 치료하면 종종 심각하고 때로는 치명적인 독성이 발생합니다. CART 세포 치료 후 가장 흔한 독성에는 면역 이펙터 세포 관련 신경독성 증후군(ICANS)이라고도 하는 CRS 및 NI의 발생이 포함됩니다8,9. CRS는 생체 내에서 CART 세포의 과잉 활성화 및 대규모 확장으로 인해 발생하며, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함한 여러 염증성 사이토카인의 후속 분비를 유발합니다. 이로 인해 저혈압, 고열, 모세 혈관 누출 증후군, 호흡 부전, 다기관 부전 및 경우에 따라 사망이 발생합니다10,11. CRS는 CART19 세포 요법 후 사례의 50-100%에서 발생합니다11,12,13. ICANS는 CART 세포 치료와 관련된 또 다른 독특한 부작용이며 전신 뇌부종, 착란, 폐쇄, 실어증, 운동 약화 및 때때로 발작을 특징으로 합니다 9,14. 모든 등급의 ICANS는 환자의 최대 70%에서 발생하며 3-4등급은 환자의 20-30%에서 보고됩니다 5,10,15,16. 전반적으로 CRS와 ICANS는 일반적이며 치명적일 수 있습니다.

CART 세포 치료 후 ICANS의 관리는 어렵습니다. 대부분의 ICANS 환자는 또한 CRS17을 경험하며, 이는 종종 IL-6 수용체 길항제 토실리주맙 또는 스테로이드18로 치료할 수 있습니다. 이전 보고서에서는 토실리주맙을 사용한 조기 개입이 중증 CRS의 비율을 감소시켰지만 ICANS의 발생률이나 중증도에는 영향을 미치지 않았다고 밝혔습니다 19. 현재 ICANS에 대한 효과적인 치료법이나 예방약은 없으며, 예방 전략을 조사하는 것이 중요하다20.

골수 세포 및 관련 사이토카인/케모카인은 CRS 및 ICANS21 발달의 주요 동인으로 생각됩니다. CRS는 사이토카인 및 T 세포 확장의 극단적인 상승과 직접적인 관련이 있지만 ICANS의 병태생리학은 거의 알려지지 않았습니다22,23. 따라서 CART 세포 치료 후 이러한 독성을 요약하는 마우스 모델을 구축하여 메커니즘을 연구하고 예방 전략을 개발하는 것이 필수적입니다.

현재 CART 세포의 효능을 연구, 최적화 및 검증하고 관련 독성을 모니터링하는 데 사용되는 여러 전임상 동물 모델이 있습니다. 여기에는 영장류 모델 외에도 동계, 이종 이식편, 면역 적격 형질 전환, 인간화 형질 전환 및 환자 유래 이종 이식 마우스가 포함됩니다. 그러나, 이들 모델들 각각은 단점을 가지며, 일부는 CART 세포의 진정한 효능 또는 안전성 우려를 반영하지 않는다24,25. 따라서 연구의 의도 된 목표에 가장 적합한 모델을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.

이 기사에서는 ALL 환자 유래 이종이식(PDX) 생체 내 모델을 사용하여 CART 세포 관련 독성, CRS 및 NI를 평가하는 데 사용되는 방법론을 설명하고자 합니다(그림 1). 구체적으로, 여기에 기술된 방법에서, 저자의 실험실에서 생성된 CART19 세포는 이전에 기술된 프로토콜에 따라 사용된다. 간단히 말해서, 인간 T 세포는 밀도 구배 기술을 통해 건강한 기증자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리되고, 0일에 CD3/CD28 비드로 자극되고, 4-1BB 및 CD3ζ 신호 전달 도메인에 융합된 CD19 표적 단일 사슬 가변 단편으로 구성된 CAR로 1일째에 렌티바이러스로 형질도입됩니다. 이어서, 이들 CART 세포는 확장되고, 6일째에 비드화되고, 8일째 26,27,28,29,30일에 냉동보존된다. 앞서 설명한 바와 같이, 마우스는 림프구 고갈 치료를 받은 후 환자 유래 백혈병 모세포(ALL)를 투여합니다28. 첫째, 종양 생착은 턱밑 혈액 수집을 통해 확인됩니다. 적절한 종양 부담의 확립 후, CART19 세포를 마우스에 투여한다. 그런 다음 웰빙을 평가하기 위해 매일 생쥐의 체중을 측정합니다. 소동물 자기공명영상(MRI)은 NI를 평가하기 위해 수행되며, T 세포 확장 및 사이토카인/케모카인 생성을 평가하기 위해 꼬리 출혈과 함께 수행됩니다. 아래에 설명된 기술은 PDX 모델에서 CART 세포 관련 독성을 연구하기 위한 모델로 사용하는 것이 좋습니다.

Protocol

이 프로토콜은 Mayo Clinic의 IRB(Institutional Review Board), IACUC A00001767(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 IBC(Institutional Biosafety Committee)의 지침을 따릅니다. 알림: 마우스와 함께 작업하는 데 사용되는 모든 재료는 멸균 상태여야 합니다. 1. NSG 마우스에 busulfan 주사 8-12주령의 수컷 면역저하 NOD-SCID IL2rγnull(NSG) 마우스를 채취하여 주사 전에 체…

Representative Results

이 프로토콜의 목적은 ALL 환자의 종양 세포에서 PDX 마우스 모델을 사용하여 CART 세포 관련 독성을 평가하는 것입니다(그림 1). 첫째, NSG 마우스는 i.p. 면역억제 및 CART 세포 생착 촉진을 목표로 부설판(30mg/kg)주사 28. 다음 날, 그들은 모든 환자로부터 파생된 ~5 ×10 6 PBMC(i.v.)를 받았습니다. 마우스는 꼬리 출혈 분석을 통해 ~13주 동안 생착에 대해…

Discussion

이 보고서에서는 ALL PDX 모델을 사용하여 CART 세포 관련 독성을 평가하는 방법론을 설명했습니다. 보다 구체적으로, 이 모델은 환자가 CART 세포 주입 후 종종 경험하는 두 가지 생명을 위협하는 독성인 CRS와 NI를 모방하려고 합니다. 그것은 클리닉에서 관찰된 CART 독성의 많은 특징을 요약합니다: 체중 감소, 운동 기능 장애, 신경염증, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성, 중추 신경계로의 상이한 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 국립 보건원 (R37CA266344, 1K99CA273304), 국방부 (CA201127), 메이요 클리닉 K2R 파이프 라인 (S.S.K.), 메이요 클리닉 개별 의학 센터 (S.S.K.) 및 프레돌린 재단 (RLS). 또한 Mayo Clinic NMR Core Facility 직원에게도 감사드립니다. 그림 1 은 BioRender.com 에서 작성되었습니다.

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
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Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
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