هنا ، نصف بروتوكولا يتم فيه استخدام نموذج xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم ومراقبة السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري التي تستهدف CD19.
برز العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) كأداة قوية لعلاج أنواع متعددة من الأورام الخبيثة CD19 + ، مما أدى إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مؤخرا على العديد من علاجات الخلايا CART (CART19) التي تستهدف CD19. ومع ذلك ، يرتبط العلاج بالخلايا CART بمجموعة فريدة من السميات التي تحمل معدلات المراضة والوفيات الخاصة بها. وهذا يشمل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والالتهاب العصبي (NI). كان استخدام نماذج الفئران قبل السريرية أمرا حاسما في البحث والتطوير لتكنولوجيا CART لتقييم كل من فعالية CART وسمية CART. تشمل النماذج قبل السريرية المتاحة لاختبار هذا العلاج المناعي الخلوي بالتبني نماذج الفئران الجينية ، و xenograft ، والمعدلة وراثيا ، والإنسانية. لا يوجد نموذج واحد يعكس بسلاسة جهاز المناعة البشري ، ولكل نموذج نقاط قوة وضعف. تهدف ورقة الطرق هذه إلى وصف نموذج xenograft المشتق من المريض باستخدام أرومات اللوكيميا من المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم السمية المرتبطة ب CART19 ، CRS ، و NI. وقد ثبت أن هذا النموذج يلخص السمية المرتبطة ب CART19 بالإضافة إلى الفعالية العلاجية كما رأينا في العيادة.
أحدث العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان. لقد أثبت نجاحه في علاج سرطان الدم الليمفاوي الحاد الانتكاسي / المقاوم (ALL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي ، والورم النقوي المتعدد1،2،3،4،5،6،7 ، مما أدى إلى موافقات إدارة الغذاء والدواء الأخيرة. على الرغم من النجاح الأولي في التجارب السريرية ، فإن العلاج بخلايا CART يؤدي إلى سميات غالبا ما تكون شديدة ومميتة في بعض الأحيان. تشمل السميات الأكثر شيوعا بعد العلاج بخلايا CART تطوير CRS و NI ، والتي يشار إليها أيضا باسم متلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المستجيبة المناعية (ICANS) 8,9. يحدث CRS بسبب الإفراط في التنشيط والتوسع الهائل لخلايا CART في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى إفراز لاحق للعديد من السيتوكينات الالتهابية ، بما في ذلك γ الإنترفيرون ، وعامل نخر الورم α ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) ، والإنترلوكين -6 (IL-6). هذا يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم ، وارتفاع في درجة الحرارة ، ومتلازمة تسرب الشعيرات الدموية ، وفشل الجهاز التنفسي ، وفشل متعدد الأعضاء ، وفي بعض الحالات ، الموت10,11. يتطور CRS في 50-100٪ من الحالات بعد العلاج بالخلايا CART1911،12،13. ICANS هو حدث ضار فريد آخر مرتبط بالعلاج بخلايا CART ويتميز بالوذمة الدماغية المعممة ، والارتباك ، والانقطاع ، وفقدان القدرة على الكلام ، والضعف الحركي ، وأحيانا النوبات 9,14. تحدث أي درجة من ICANS في ما يصل إلى 70٪ من المرضى ، ويتم الإبلاغ عن الدرجات 3-4 في 20-30٪ من المرضى5،10،15،16. بشكل عام ، CRS و ICANS شائعان ويمكن أن يكونا قاتلين.
تمثل إدارة ICANS بعد العلاج بالخلايا CART تحديا. يعاني معظم المرضى الذين يعانون من ICANS أيضا من CRS17 ، والذي يمكن علاجه غالبا باستخدام مضاد مستقبلات IL-6 توسيليزوماب أو المنشطات18. كشف تقرير سابق أن التدخل المبكر مع توسيليزوماب قلل من معدل CRS الشديد ولكنه لم يؤثر على حدوث أو شدة ICANS19. في الوقت الحالي ، لا يوجد علاج فعال أو عامل وقائي ل ICANS ، ومن الأهمية بمكان التحقيق في الاستراتيجيات الوقائية20.
يعتقد أن الخلايا النخاعية والسيتوكينات / الكيموكينات المرتبطة بها هي الدوافع الرئيسية لتطوير CRS و ICANS21. في حين أن CRS يرتبط ارتباطا مباشرا بالارتفاع الشديد للسيتوكينات وتوسع الخلايا التائية ، فإن الفيزيولوجيا المرضية ل ICANS غير معروفة إلى حد كبير22,23. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج فأر يلخص هذه السميات بعد العلاج بخلايا CART لدراسة الآليات وتطوير الاستراتيجيات الوقائية.
هناك العديد من النماذج الحيوانية قبل السريرية المستخدمة حاليا لدراسة وتحسين والتحقق من فعالية خلايا CART ، وكذلك لمراقبة السمية المرتبطة بها. وتشمل هذه الفئران الوراثية ، والطعم الأجنبي ، والمعدلة وراثيا ذات الكفاءة المناعية ، والمعدلة وراثيا المتوافقة مع البشر ، والفئران المشتقة من المريض ، بالإضافة إلى نماذج الرئيسيات. ومع ذلك ، فإن كل نموذج من هذه النماذج له عيوب ، وبعضها لا يعكس الفعالية الحقيقية أو مخاوف السلامة لخلايا CART24,25. لذلك ، لا بد من اختيار أفضل نموذج بعناية للأهداف المقصودة من الدراسة.
تسعى هذه المقالة إلى وصف المنهجية المستخدمة لتقييم السميات المرتبطة بخلايا CART ، CRS و NI ، باستخدام نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) في الجسم الحي (الشكل 1). على وجه التحديد ، في الطرق الموضحة هنا ، يتم استخدام خلايا CART19 التي تم إنشاؤها في مختبر المؤلفين باتباع البروتوكولات الموصوفة مسبقا. باختصار ، يتم عزل الخلايا التائية البشرية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية من متبرع سليم (PBMCs) عبر تقنية تدرج الكثافة ، ويتم تحفيزها بخرز CD3 / CD28 في اليوم 0 ، ويتم تحويلها عدسيا في اليوم الأول مع CARs المكونة من جزء متغير أحادي السلسلة يستهدف CD19 يندمج في مجالات إشارات 4-1BB و CD3ζ. ثم يتم توسيع خلايا CART هذه ، وإزالة الخرز في اليوم 6 ، وحفظها بالتبريد في اليوم 826،27،28،29،30. كما هو موضح سابقا ، تخضع الفئران للعلاج اللمفاوي المستنفد ، يليه إعطاء أرومات اللوكيميا المشتقة من المريض (ALL)28. أولا ، يتم التحقق من تطعيم الورم عن طريق جمع الدم تحت الفك السفلي. بعد إنشاء عبء الورم المناسب ، يتم إعطاء خلايا CART19 للفئران. بعد ذلك ، يتم وزن الفئران يوميا لتقييم الرفاهية. يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة (MRI) لتقييم NI ، جنبا إلى جنب مع نزيف الذيل لتقييم توسع الخلايا التائية وإنتاج السيتوكين / الكيموكين. يوصى بشدة باستخدام التقنيات الموضحة أدناه كنموذج لدراسة السميات المرتبطة بخلايا CART في نموذج PDX.
في هذا التقرير ، تم وصف منهجية لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج ALL PDX. وبشكل أكثر تحديدا ، يسعى هذا النموذج إلى تقليد سميتين تهددان الحياة ، CRS و NI ، والتي غالبا ما يعاني منها المرضى بعد ضخ خلايا CART. يلخص العديد من السمات المميزة لسمية CART التي لوحظت في العيادة: فقدان الوزن ، وال?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المعاهد الوطنية للصحة (R37CA266344 ، 1K99CA273304) ، ووزارة الدفاع (CA201127) ، وخط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ، ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ، ومؤسسة Predolin (R.L.S.). بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر موظفي مرفق الرنين المغناطيسي النووي الأساسي في Mayo Clinic. تم إنشاء الشكل 1 في عام BioRender.com
APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |