Valutazione delle tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico utilizzando un modello murino di xenotrapianto derivato dal paziente per la leucemia linfoblastica acuta

Summary

Qui, descriviamo un protocollo in cui un modello di xenotrapianto derivato dal paziente di leucemia linfoblastica acuta viene utilizzato come strategia per valutare e monitorare le tossicità associate alle cellule T del recettore dell’antigene chimerico mirato al CD19.

Abstract

La terapia cellulare del recettore T dell’antigene chimerico (CART) è emersa come un potente strumento per il trattamento di più tipi di tumori maligni CD19 ⁺ , che ha portato alla recente approvazione da parte della FDA di diverse terapie cellulari CART (CART19) mirate al CD19. Tuttavia, la terapia cellulare CART è associata a un insieme unico di tossicità che portano la loro morbilità e mortalità. Ciò include la sindrome da rilascio di citochine (CRS) e la neuroinfiammazione (NI). L’uso di modelli murini preclinici è stato cruciale nella ricerca e nello sviluppo della tecnologia CART per valutare sia l’efficacia che la tossicità CART. I modelli preclinici disponibili per testare questa immunoterapia cellulare adottiva includono modelli murini singeneici, xenotrapianti, transgenici e umanizzati. Non esiste un singolo modello che rispecchi perfettamente il sistema immunitario umano e ogni modello ha punti di forza e di debolezza. Questo documento sui metodi mira a descrivere un modello di xenotrapianto derivato dal paziente utilizzando blasti leucemici da pazienti con leucemia linfoblastica acuta come strategia per valutare le tossicità associate a CART19, CRS e NI. Questo modello ha dimostrato di ricapitolare le tossicità associate a CART19 e l’efficacia terapeutica come visto nella clinica.

Introduction

La terapia cellulare del recettore dell’antigene chimerico T (CART) ha rivoluzionato il campo dell’immunoterapia del cancro. Ha dimostrato di avere successo nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta recidivante / refrattaria (LLA), del linfoma a grandi cellule B, del linfoma mantellare, del linfoma follicolare e del mieloma multiplo 1,2,3,4,5,6,7^, portando a recenti approvazioni della FDA. Nonostante il successo iniziale negli studi clinici, il trattamento con terapia cellulare CART provoca tossicità spesso gravi e occasionalmente letali. Le tossicità più comuni dopo la terapia cellulare CART includono lo sviluppo di CRS e NI, noti anche come sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS)^8,9. La CRS è causata dalla sovraattivazione e dalla massiccia espansione delle cellule CART in vivo, che porta alla successiva secrezione di più citochine infiammatorie, tra cui interferone-γ, fattore di necrosi tumorale α, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e interleuchina-6 (IL-6). Ciò si traduce in ipotensione, febbre alta, sindrome da perdita capillare, insufficienza respiratoria, insufficienza multiorgano e, in alcuni casi, morte^10,11. La CRS si sviluppa nel 50-100% dei casi dopo terapia cellulare CART19^11,12,13. ICANS è un altro evento avverso unico associato alla terapia cellulare CART ed è caratterizzato da edema cerebrale generalizzato, confusione, ottunndazione, afasia, debolezza motoria e, occasionalmente, convulsioni ^9,14. Qualsiasi grado di ICANS si verifica fino al 70% dei pazienti e i gradi 3-4 sono riportati nel 20-30% dei pazienti 5,10,15,16. Nel complesso, CRS e ICANS sono comuni e possono essere fatali.

La gestione di ICANS dopo terapia cellulare CART è impegnativa. La maggior parte dei pazienti con ICANS sperimenta anche CRS¹⁷, che spesso può essere trattata con l’antagonista del recettore IL-6 tocilizumab o steroidi¹⁸. Un precedente rapporto ha rivelato che l’intervento precoce con tocilizumab ha ridotto il tasso di CRS grave, ma non ha influenzato l’incidenza o la gravità di ICANS¹⁹. Attualmente, non esiste un trattamento efficace o un agente profilattico per ICANS ed è fondamentale studiare strategie preventive²⁰.

Si ritiene che le cellule mieloidi e le citochine/chemochine associate siano i principali motori dello sviluppo di CRS e ICANS²¹. Mentre la CRS è direttamente correlata all’estrema elevazione delle citochine e all’espansione delle cellule T, la fisiopatologia di ICANS è in gran parte sconosciuta^22,23. Pertanto, è imperativo stabilire un modello murino che riassuma queste tossicità dopo la terapia cellulare CART per studiare i meccanismi e sviluppare strategie preventive.

Esistono diversi modelli animali preclinici attualmente utilizzati per studiare, ottimizzare e convalidare l’efficacia delle cellule CART, nonché per monitorare le loro tossicità associate. Questi includono topi singeneici, xenograft, transgenici immunocompetenti, transgenici umanizzati e xenograft derivati dal paziente, oltre a modelli di primati. Tuttavia, ciascuno di questi modelli presenta degli svantaggi e alcuni non riflettono i veri problemi di efficacia o sicurezza delle celle CART^24,25. Pertanto, è imperativo scegliere attentamente il modello migliore per gli obiettivi previsti dello studio.

Questo articolo cerca di descrivere la metodologia utilizzata per valutare le tossicità associate alle cellule CART, CRS e NI, utilizzando un modello in vivo di xenotrapianto derivato da pazienti (PDX) ALL (Figura 1). In particolare, nei metodi qui descritti, le cellule CART19 generate nel laboratorio degli autori vengono utilizzate seguendo i protocolli precedentemente descritti. In breve, le cellule T umane vengono isolate da cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) di donatori sani tramite una tecnica di gradiente di densità, stimolate con perline CD3 / CD28 il giorno 0 e trasdotte lentiviralmente il giorno 1 con CAR composte da un frammento variabile a catena singola mirato a CD19 fuso a domini di segnalazione 4-1BB e CD3ζ. Queste cellule CART vengono quindi espanse, de-beaded il giorno 6 e crioconservate il giorno 8 26,27,28,29,30. Come descritto in precedenza, i topi sono sottoposti a trattamento linfodepletivo, seguito dalla somministrazione di blasti leucemici derivati dal paziente (LLA)²⁸. In primo luogo, l’attecchimento del tumore viene verificato tramite raccolta di sangue sottomandibolare. A seguito della creazione di un carico tumorale appropriato, le cellule CART19 vengono somministrate ai topi. Quindi, i topi vengono pesati quotidianamente per valutare il benessere. La risonanza magnetica per piccoli animali (MRI) viene eseguita per valutare NI, insieme al sanguinamento della coda per valutare l’espansione delle cellule T e la produzione di citochine / chemochine. Le tecniche descritte di seguito sono altamente raccomandate per essere utilizzate come modello per studiare le tossicità associate alle cellule CART in un modello PDX.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida dell’Institutional Review Board (IRB) della Mayo Clinic, dell’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) e dell’Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04). NOTA: Tutti i materiali utilizzati per lavorare con i topi devono essere sterili. 1. Iniezione di busulfan ai topi NSG Ottenere topi maschi, di 8-12 settimane, immunocompromessi, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) e pesarli …

Representative Results

Lo scopo di questo protocollo è valutare le tossicità associate alle cellule CART utilizzando un modello di topi PDX da cellule tumorali di pazienti con LLA (Figura 1). In primo luogo, i topi NSG hanno ricevuto iniezioni i.p. di busulfan (30 mg / kg) con l’obiettivo di immunosopprimerli e facilitare l’attecchimento delle cellule CART28. Il giorno seguente, hanno ricevuto ~ 5 × 106 PBMC (i.v.) derivati da TUTTI i pazienti. I topi sono stati monitorati per…

Discussion

In questo rapporto è stata descritta una metodologia per valutare le tossicità associate alle cellule CART utilizzando un modello ALL PDX. Più specificamente, questo modello cerca di imitare due tossicità potenzialmente letali, CRS e NI, che i pazienti spesso sperimentano dopo l’infusione di cellule CART. Riassume molti segni distintivi delle tossicità CART osservate nella clinica: perdita di peso, disfunzione motoria, neuroinfiammazione, produzione di citochine infiammatorie e chemochine e infiltrazione di diverse …

Materials

APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q