В данной статье мы опишем протокол, в котором модель ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом используется в качестве стратегии для оценки и мониторинга токсичности, ассоциированной с Т-клетками рецептора химерного антигена CD19.
Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) стала мощным инструментом для лечения нескольких типов злокачественных опухолей CD19+ , что привело к недавнему одобрению FDA нескольких методов клеточной терапии CD19-таргетной CART (CART19). Тем не менее, клеточная терапия CART связана с уникальным набором токсичных веществ, которые несут в себе свою заболеваемость и смертность. К ним относятся синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейровоспаление (NI). Использование доклинических мышиных моделей имеет решающее значение в исследованиях и разработках технологии CART для оценки как эффективности CART, так и токсичности CART. Доступные доклинические модели для тестирования этой адоптивной клеточной иммунотерапии включают сингенные, ксенотрансплантатные, трансгенные и гуманизированные мышиные модели. Не существует единой модели, которая бы органично отражала иммунную систему человека, и у каждой модели есть сильные и слабые стороны. Целью данной работы по методам является описание модели ксенотрансплантата пациента с использованием лейкозных бластов пациентов с острым лимфобластным лейкозом в качестве стратегии оценки токсичности, ассоциированной с CART19, CRS и NI. Было показано, что эта модель повторяет токсичность, связанную с CART19, а также терапевтическую эффективность, наблюдаемую в клинике.
Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) произвела революцию в области иммунотерапии рака. Он доказал свою эффективность в лечении рецидивирующего/рефрактерного острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), крупноклеточной В-клеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы и множественной миеломы 1,2,3,4,5,6,7, что привело к недавним одобрениям FDA. Несмотря на первоначальный успех в клинических испытаниях, лечение клеточной терапией CART приводит к токсичности, которая часто бывает тяжелой, а иногда и летальной. Наиболее распространенные токсичные явления после клеточной терапии CART включают развитие CRS и NI, также называемого синдромом нейротоксичности, ассоциированным с иммунными эффекторными клетками (ICANS)8,9. CRS вызывается гиперактивацией и массивной экспансией клеток CART in vivo, что приводит к последующей секреции нескольких воспалительных цитокинов, включая интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-6 (IL-6). Это приводит к гипотонии, высокой температуре, синдрому капиллярной утечки, дыхательной недостаточности, полиорганной недостаточности, а в некоторых случаях и к смерти10,11. СВК развивается в 50-100% случаев после клеточной терапии CART1911,12,13. ICANS является еще одним уникальным нежелательным явлением, связанным с клеточной терапией CART, и характеризуется генерализованным отеком головного мозга, спутанностью сознания, обтукцией, афазией, двигательной слабостью, а иногда и судорогами 9,14. Любая степень ICANS встречается у 70% пациентов, а степени 3-4 отмечаются у 20-30% пациентов 5,10,15,16. В целом, CRS и ICANS являются распространенными и могут привести к летальному исходу.
Ведение ICANS после клеточной терапии CART является сложной задачей. У большинства пациентов с ICANS также наблюдается СВК17, который часто можно лечить антагонистом рецепторов IL-6 тоцилизумабом или стероидами18. Предыдущее сообщение показало, что раннее вмешательство с применением тоцилизумаба снижает частоту тяжелого СВК, но не влияет на частоту или тяжесть ICANS19. В настоящее время не существует эффективного лечения или профилактического средства для ИКАНС, и крайне важно исследовать профилактические стратегии20.
Считается, что миелоидные клетки и связанные с ними цитокины/хемокины являются основными драйверами развития CRS и ICANS21. В то время как CRS напрямую связан с экстремальным повышением цитокинов и экспансией Т-клеток, патофизиология ICANS в значительной степени неизвестна22,23. Таким образом, крайне важно создать мышиную модель, которая повторяет эти токсичности после клеточной терапии CART, чтобы изучить механизмы и разработать профилактические стратегии.
В настоящее время существует множество доклинических моделей на животных, используемых для изучения, оптимизации и проверки эффективности клеток CART, а также для мониторинга связанной с ними токсичности. К ним относятся сингенные, ксенотрансплантатные, иммунокомпетентные трансгенные, гуманизированные трансгенные и полученные от пациентов ксенотрансплантаты мышей, а также модели приматов. Тем не менее, каждая из этих моделей имеет недостатки, и некоторые из них не отражают истинную эффективность или безопасность клеток CART24,25. Поэтому крайне важно тщательно выбирать оптимальную модель для предполагаемых целей исследования.
В данной статье предпринята попытка описать методологию, используемую для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, CRS и NI, с использованием модели ксенотрансплантата in vivo, полученного от пациента (PDX) in vivo (рис. 1). В частности, в описанных здесь методах используются клетки CART19, полученные в лаборатории авторов, по ранее описанным протоколам. Вкратце, Т-клетки человека выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови здорового донора (PBMC) с помощью метода градиента плотности, стимулируют шариками CD3/CD28 на 0-й день и лентививически трансдуцируют на 1-й день с помощью CAR, состоящего из одноцепочечного вариабельного фрагмента, нацеленного на CD19, слитого с сигнальными доменами 4-1BB и CD3ζ. Затем эти клетки CART расширяют, очищают от шариков на 6-й день и криоконсервируют на 8-й день 26,27,28,29,30. Как указывалось ранее, мышей подвергают лимфодеплетирующему лечению, за которым следует введение лейкозных бластов (ОЛЛ)28. Во-первых, приживление опухоли проверяется с помощью подчелюстного забора крови. После установления соответствующей опухолевой нагрузки мышам вводят клетки CART19. Затем мышей ежедневно взвешивают, чтобы оценить их самочувствие. Магнитно-резонансная томография (МРТ) мелких животных проводится для оценки NI, а также хвостового кровотечения для оценки роста Т-клеток и продукции цитокинов/хемокинов. Методы, описанные ниже, настоятельно рекомендуется использовать в качестве модели для изучения токсичности, ассоциированной с клетками CART, в модели PDX.
В настоящем отчете описана методология оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели ALL PDX. В частности, эта модель стремится имитировать две опасные для жизни токсичности, CRS и NI, которые пациенты часто испытывают после инфузии клеток CART. Он повторяет многие…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (R37CA266344, 1K99CA273304), Министерством обороны (CA201127), Клиникой Мэйо K2R (S.S.K.), Центром индивидуализированной медицины клиники Майо (S.S.K.) и Фондом Преддолин (R.L.S.). Кроме того, мы хотели бы поблагодарить персонал основного центра ЯМР клиники Майо. Рисунок 1 был создан в BioRender.com
APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |