Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas
Summary
Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA curtas que são difundidas em eucariotes. A maioria dos miRNAs são transcritas de introns, e sua maturação envolve diferentes proteínas de ligação de RNA no núcleo. MiRNAs maduras frequentemente mediam o silenciamento genético, e isso se tornou uma ferramenta importante para compreender eventos pós-transcrição. Além disso, pode ser explorado como uma metodologia promissora para terapias genéticas. No entanto, atualmente há uma falta de métodos diretos para avaliar a expressão miRNA em culturas de células mamíferas. Aqui, descrevemos um método eficiente e simples que auxilia na determinação da biogênese e maturação do miRNA através da confirmação de sua interação com sequências de destino. Além disso, este sistema permite a separação da maturação exógena do miRNA de sua atividade endógena usando um promotor indutível de doxiciclina capaz de controlar a transcrição miRNA primária (pri-miRNA) com alta eficiência e baixo custo. Esta ferramenta também permite a modulação com proteínas de ligação de RNA em um plasmídeo separado. Além de seu uso com uma variedade de diferentes miRNAs e seus respectivos alvos, ele pode ser adaptado a diferentes linhas celulares, desde que sejam favoráveis à transfecção.
Introduction
O splicing precursor de mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética em eucariotes1. A remoção de introns e a união de exons em RNA maduro é catalisada pelo emendatoroso, um complexo de 2 megadalton ribonucleoproteína composto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) juntamente com mais de 100 proteínas 2,3. A reação de emenda ocorre co-transcrição, e o emendamento é montado a cada novo intron guiado pelo reconhecimento de locais de emenda conservados nos limites exon-intron e dentro do intron4. Diferentes introns podem ter diferentes taxas de emenda, apesar da notável conservação do complexo de emendas e seus componentes. Além das diferenças na conservação do local de emenda, as sequências regulatórias distribuídas em introns e exons podem guiar proteínas de ligação de RNA (RBP) e estimular ou reprimiro splicing 5,6. HuR é um RBP onipresentemente expresso e é um fator importante para controlar a estabilidade do mRNA7. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que o HuR pode se ligar a introns contendo miRNAs, indicando que essa proteína pode ser um fator importante para facilitar o processamento e a maturação do miRNA, levando também à geração de isóformes alternativos de emenda 6,8,9.
Muitas microRNAs (miRNAs) são codificadas a partir de sequências intrônicas. Enquanto alguns fazem parte do intron, outros são conhecidos como “mirtrons” e são formados por todo o intron10,11. miRNAs são RNAs curtas sem codificação, variando de 18 a 24 nucleotídeos no comprimento12. Sua sequência madura mostra complementaridade parcial ou total com sequências de destino em mRNAs, afetando, portanto, taxas de decadência de tradução e/ou mRNA. As combinações de miRNAs e alvos levam a célula a diferentes resultados. Vários miRNAs podem conduzir células para fenótipos pró ou anti-tumorais13. MiRNAs oncogênicas geralmente têm como alvo mRNAs que desencadeiam uma característica supressiva, levando ao aumento da proliferação celular, migração e invasão14. Por outro lado, miRNAs supressivas de tumores podem atingir mRNAs oncogênicas ou mRNAs relacionados ao aumento da proliferação celular.
O processamento e o amadurecimento das miRNAs também dependem de sua origem. A maioria dos miRNAs intrônicos são processados com a participação do microprocessador, formado pela ribonuclease Drosha e cofatores proteicos12. Mirtrons são processados com a atividade do emendarosome independentemente de Drosha15. Considerando a alta frequência de miRNAs encontradas dentro dos introns, imaginamos que as proteínas de ligação de RNA envolvidas com o splicing também poderiam facilitar o processamento e a maturação desses miRNAs. Notavelmente, o RBP hnRNP A2/B1 já foi associado com o microprocessador e a biogênese miRNA16.
Já relatamos anteriormente que várias proteínas de ligação de RNA, como hnRNPs e HuR, estão associadas a miRNAs intrônicas por espectrometria de massa17. A associação de HuR (ELAVL1) com miRNAs do cluster tronic miR-17-92 foi confirmada por meio de imunoprecipitação e na análise de silico 9. miR-17-92 é um cluster miRNA intrônico composto por seis miRNAs com expressão aumentada em diferentes cânceres18,19. Este cluster também é conhecido como “oncomiR-1” e é composto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b, e miR-92a. miR-19a e miR-19b estão entre os miRNAs mais oncogênicos deste cluster19. O aumento da expressão do HuR estimula a síntese miR-19a e miR-19b 9. Uma vez que as regiões intrônicas que flanqueiam este aglomerado estão associadas ao HuR, desenvolvemos um método para investigar se essa proteína poderia regular a expressão e a maturação de miR-19b. Uma previsão importante de nossa hipótese foi que, como proteína regulatória, o HuR poderia facilitar a biogênese do miRNA, levando a alterações fenotípicas. Uma possibilidade era que os miRNAs fossem processados pela estimulação do HuR, mas não seriam maduros e funcionais e, portanto, os efeitos da proteína não impactariam diretamente o fenótipo. Por isso, desenvolvemos um ensaio de repórter emenda para investigar se um RBP como o HuR poderia afetar a biogênese e o amadurecimento de um miRNA intronic. Ao confirmar o processamento e amadurecimento do miRNA, nosso ensaio mostra a interação com a sequência de destino e a geração de um miRNA maduro e funcional. Em nosso ensaio, acoplamos a expressão de um aglomerado de miRNA intrônico com um plasmídeo de luciferase para verificar se há ligação de alvo de miRNA em células cultivadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O emenda pré-mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética, e seu controle pode desencadear efeitos fortes sobre modificações fenotípicascelulares 22,23. Mais de 70% dos miRNAs são transcritos de introns em humanos, e nós imaginamos que seu processamento e maturação poderiam ser facilitados por emendar proteínas regulatórias24,25. Desenvolvemos um método para analisa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos a E. Makeyev (Nanyang Technology University, Cingapura) pelas células HeLa-Cre e plasmídeos pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Agradecemos o apoio de Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
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| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
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| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
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| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
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| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
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| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
- Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
- Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
- Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
- Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
- Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
- Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
- Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
- Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
- Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
- Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
- Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
- Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
- Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
- Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
- Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).
