Summary

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Abstract

MicroRNA’s (miRNA’s) zijn korte RNA-moleculen die wijdverspreid zijn in eukaryoten. De meeste miRNA’s worden getranscribeerd van introns en hun rijping omvat verschillende RNA-bindende eiwitten in de kern. Volwassen miRNA’s bemiddelen vaak gen-uitschakeling, en dit is een belangrijk hulpmiddel geworden voor het begrijpen van post-transcriptionele gebeurtenissen. Daarnaast kan het worden onderzocht als een veelbelovende methodologie voor gentherapieën. Er is momenteel echter een gebrek aan directe methoden voor het beoordelen van miRNA-expressie in zoogdiercelculturen. Hier beschrijven we een efficiënte en eenvoudige methode die helpt bij het bepalen van miRNA-biogenese en rijping door bevestiging van de interactie met doelsequenties. Dit systeem maakt ook de scheiding mogelijk van exogene miRNA-rijping van zijn endogene activiteit met behulp van een doxycycline-induceerbare promotor die in staat is om primaire miRNA (pri-miRNA) transcriptie met hoge efficiëntie en lage kosten te beheersen. Deze tool maakt ook modulatie met RNA-bindende eiwitten in een apart plasmide mogelijk. Naast het gebruik ervan met een verscheidenheid aan verschillende miRNA’s en hun respectieve doelen, kan het worden aangepast aan verschillende cellijnen, op voorwaarde dat deze vatbaar zijn voor transfectie.

Introduction

Precursor mRNA splicing is een belangrijk proces voor genexpressieregulatie in eukaryoten1. De verwijdering van introns en de vereniging van exonen in volwassen RNA wordt gekatalyseerd door het spliceosoom, een ribonucleoproteïnecomplex van 2 megadalton dat bestaat uit 5 snRNA’s (U1, U2, U4, U5 en U6) samen met meer dan 100 eiwitten 2,3. De splicingreactie vindt co-transcriptioneel plaats en het spliceosoom wordt geassembleerd bij elk nieuw intron geleid door de herkenning van geconserveerde spliceplaatsen op exon-introngrenzen en binnen het intron4. Verschillende introns kunnen verschillende splicingsnelheden hebben, ondanks de opmerkelijke conservering van het spliceosoomcomplex en zijn componenten. Naast de verschillen in het behoud van de splice-site, kunnen regulerende sequenties verdeeld over introns en exonen RNA-bindende eiwitten (RBP) sturen en splicing 5,6 stimuleren of onderdrukken. HuR is een alomtegenwoordig tot expressie gebrachte RBP en is een belangrijke factor om mRNA-stabiliteit te beheersen7. Eerdere resultaten van onze groep toonden aan dat HuR kan binden aan introns die miRNA’s bevatten, wat aangeeft dat dit eiwit een belangrijke factor kan zijn om miRNA-verwerking en rijping te vergemakkelijken, wat ook leidt tot het genereren van alternatieve splicingisovormen 6,8,9.

Veel microRNA’s (miRNA’s) zijn gecodeerd vanuit intronische sequenties. Terwijl sommige deel uitmaken van de intron, staan andere bekend als “mirtrons” en worden gevormd door de gehele intron 10,11. miRNA’s zijn korte niet-coderende RNA’s, variërend van 18 tot 24 nucleotiden in lengte12. Hun volwassen sequentie vertoont gedeeltelijke of volledige complementariteit met doelsequenties in mRNA’s, waardoor de translatie- en/of mRNA-vervalsnelheden worden beïnvloed. De combinaties van miRNA’s en doelen drijven de cel naar verschillende uitkomsten. Verschillende miRNA’s kunnen cellen naar pro- of antitumorale fenotypendrijven 13. Oncogene miRNA’s richten zich meestal op mRNA’s die een onderdrukkend kenmerk veroorzaken, wat leidt tot verhoogde cellulaire proliferatie, migratie en invasie14. Aan de andere kant kunnen tumorsuppressieve miRNA’s zich richten op oncogene mRNA’s of mRNA’s die verband houden met verhoogde celproliferatie.

De verwerking en rijping van miRNA’s zijn ook afhankelijk van hun oorsprong. De meeste intronische miRNA’s worden verwerkt met deelname van de microprocessor, gevormd door de ribonuclease Drosha en eiwitcofactoren12. Mirtrons worden verwerkt met de activiteit van het spliceosoom onafhankelijk van Drosha15. Gezien de hoge frequentie van miRNA’s in introns, veronderstelden we dat RNA-bindende eiwitten die betrokken zijn bij splicing ook de verwerking en rijping van deze miRNA’s zouden kunnen vergemakkelijken. Met name de RBP hnRNP A2/B1 is al in verband gebracht met de microprocessor en miRNA-biogenese16.

We hebben eerder gemeld dat verschillende RNA-bindende eiwitten, zoals hnRNPs en HuR, geassocieerd zijn met intronische miRNA’s door massaspectrometrie17. HuR’s (ELAVL1) associatie met miRNA’s uit de miR-17-92 intronische cluster werd bevestigd met behulp van immunoprecipitatie en in silico-analyse 9. miR-17-92 is een intronisch miRNA-cluster bestaande uit zes miRNA’s met verhoogde expressie in verschillende kankers18,19. Dit cluster staat ook bekend als “oncomiR-1” en bestaat uit miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b en miR-92a. miR-19a en miR-19b behoren tot de meest oncogene miRNA’s van dit cluster19. De verhoogde expressie van HuR stimuleert miR-19a en miR-19b synthese9. Omdat intronische gebieden die dit cluster flankeren geassocieerd zijn met HuR, hebben we een methode ontwikkeld om te onderzoeken of dit eiwit miR-19a en miR-19b expressie en rijping kan reguleren. Een belangrijke voorspelling van onze hypothese was dat HuR, als regulerend eiwit, miRNA-biogenese zou kunnen vergemakkelijken, wat zou leiden tot fenotypische veranderingen. Een mogelijkheid was dat miRNA’s werden verwerkt door de stimulatie van HuR, maar niet volwassen en functioneel zouden zijn en daarom zouden de effecten van het eiwit het fenotype niet direct beïnvloeden. Daarom hebben we een splicing reporter assay ontwikkeld om te onderzoeken of een RBP zoals HuR de biogenese en rijping van een intronisch miRNA kan beïnvloeden. Door miRNA-verwerking en -rijping te bevestigen, toont onze test de interactie met de doelsequentie en de generatie van een volwassen en functioneel miRNA. In onze test koppelen we de expressie van een intronisch miRNA-cluster aan een luciferaseplasmide om te controleren op miRNA-doelbinding in gekweekte cellen.

Protocol

Een overzicht van het hier beschreven protocol is weergegeven in figuur 1. 1. Plasmide constructie pCAGGS-Cre: Dit plasmide werd geleverd door Dr. E. Makeyev21. pRD-miR-17-92:Amplify pre-miR-17-92 door PCR met behulp van 0,5 μM van elke specifieke primer (Tabel van Materialen), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-buffer en 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase. Voer een …

Representative Results

Onze eerste hypothese was dat HuR intronische miRNA-biogenese zou kunnen vergemakkelijken door zich te binden aan zijn pre-miRNA-sequentie. De verbinding van HuR-expressie en miR-17-92 clusterbiogenese zou dus kunnen wijzen op een nieuw mechanisme dat de rijping van deze miRNA’s regelt. Overexpressie van HuR bij transfectie van pFLAG-HuR werd bevestigd in drie verschillende cellijnen: HeLa, BCPAP en HEK-293T (Figuur 2). Als controles werden niet-getransfecteerde cellen en cellen get…

Discussion

Pre-mRNA-splicing is een belangrijk proces voor genexpressieregulatie en de controle ervan kan sterke effecten op celfenotypische modificaties veroorzaken22,23. Meer dan 70% van de miRNA’s wordt getranscribeerd van introns bij mensen, en we veronderstelden dat hun verwerking en rijping zou kunnen worden vergemakkelijkt door regulerende eiwittente splitsen 24,25. We ontwikkelden een methode om intronische …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) dankbaar voor de HeLa-Cre cellen en pRD-RIPE en pCAGGS-Cre plasmiden. We bedanken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes en Anselmo Moriscot voor hun steun.

Materials

Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

View Video