JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

فحص مراسل لتحليل نضج الحمض النووي الريبي الميكروي الإنتروني في خلايا الثدييات

Published: June 16, 2022
doi:
10.3791/63498
,
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas,Universidade de São Paulo

Summary

قمنا بتطوير فحص مراسل التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال الميكروي الإنتروني لاستخدامه في الخلايا في المختبر مع أربعة بلازميدات: واحد مع miRNA intronic ، واحد مع الهدف ، واحد للمبالغة في التعبير عن بروتين تنظيمي ، وواحد ل Renilla luciferase. تمت معالجة miRNA ويمكنه التحكم في تعبير luciferase عن طريق الارتباط بالتسلسل المستهدف.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) هي جزيئات RNA قصيرة منتشرة على نطاق واسع في حقيقيات النوى. يتم نسخ معظم miRNAs من الإنترونات ، ويتضمن نضجها بروتينات مختلفة مرتبطة بالحمض النووي الريبي في النواة. غالبا ما تتوسط الحمض النووي الريبوزي المرسال الناضج في إسكات الجينات ، وقد أصبح هذا أداة مهمة لفهم أحداث ما بعد النسخ. إلى جانب ذلك ، يمكن استكشافه كمنهجية واعدة للعلاجات الجينية. ومع ذلك ، هناك حاليا نقص في الطرق المباشرة لتقييم تعبير miRNA في مزارع خلايا الثدييات. هنا ، نصف طريقة فعالة وبسيطة تساعد في تحديد التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال ونضجه من خلال تأكيد تفاعله مع التسلسلات المستهدفة. أيضا ، يسمح هذا النظام بفصل نضج miRNA الخارجي عن نشاطه الداخلي باستخدام مروج مستحث للدوكسيسيكلين قادر على التحكم في نسخ miRNA الأولي (pri-miRNA) بكفاءة عالية وتكلفة منخفضة. تسمح هذه الأداة أيضا بالتشكيل باستخدام بروتينات ربط الحمض النووي الريبي في بلازميد منفصل. بالإضافة إلى استخدامه مع مجموعة متنوعة من miRNAs المختلفة وأهدافها الخاصة ، يمكن تكييفها مع خطوط الخلايا المختلفة ، شريطة أن تكون قابلة للنقل.

Introduction

يعد ربط الحمض النووي الريبوزي المرسال السلائف عملية مهمة لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى1. يتم تحفيز إزالة الإنترونات واتحاد الإكسونات في الحمض النووي الريبي الناضج بواسطة spliceosome ، وهو مركب بروتين ريبي نووي 2 ميجادالتون يتكون من 5 snRNAs (U1 و U2 و U4 و U5 و U6) إلى جانب أكثر من 100 بروتين 2,3. يحدث تفاعل الربط بشكل مشترك ، ويتم تجميع spliceosome في كل إنترون جديد مسترشدا بالتعرف على مواقع الربط المحفوظة عند حدود exon-intron وداخل intron4. قد يكون للإنترونات المختلفة معدلات ربط مختلفة على الرغم من الحفظ الملحوظ لمجمع spliceosome ومكوناته. بالإضافة إلى الاختلافات في الحفاظ على موقع الربط ، يمكن للتسلسلات التنظيمية الموزعة على الإنترونات والإكسونات توجيه البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBP) وتحفيز أو قمع الربط 5,6. HuR هو RBP يتم التعبير عنه في كل مكان وهو عامل مهم للتحكم في استقرار mRNA7. أظهرت النتائج السابقة من مجموعتنا أن HuR يمكن أن يرتبط بالإنترونات التي تحتوي على miRNAs ، مما يشير إلى أن هذا البروتين قد يكون عاملا مهما لتسهيل معالجة miRNA ونضجه ، مما يؤدي أيضا إلى توليد أشكال ربط بديلة 6,8,9.

يتم ترميز العديد من microRNAs (miRNAs) من تسلسلات إنترونية. في حين أن بعضها جزء من الإنترون ، فإن البعض الآخر يعرف باسم “mirtrons” ويتم تشكيله بواسطة intron10,11 بأكمله. miRNAs هي RNAs قصيرة غير مشفرة ، تتراوح من 18 إلى 24 نيوكليوتيدات في الطول12. يظهر تسلسلها الناضج تكاملا جزئيا أو كليا مع التسلسلات المستهدفة في mRNAs ، مما يؤثر على الترجمة و / أو معدلات اضمحلال mRNA. مجموعات من miRNAs والأهداف تدفع الخلية إلى نتائج مختلفة. يمكن للعديد من miRNAs دفع الخلايا إلى الأنماط الظاهرية المؤيدة أو المضادة للوذكور13. عادة ما تستهدف miRNAs السرطانية المنشأ mRNAs التي تؤدي إلى خاصية قمعية ، مما يؤدي إلى زيادة الانتشار الخلوي والهجرة والغزو14. من ناحية أخرى ، قد تستهدف miRNAs المثبطة للورم mRNAs المسببة للأورام أو mRNAs المتعلقة بزيادة انتشار الخلايا.

تعتمد معالجة ونضج miRNAs أيضا على أصلها. تتم معالجة معظم miRNAs الإنترونية بمشاركة المعالج الدقيق ، الذي يتكون من الريبونوكلياز دروشا والعوامل المساعدة للبروتين12. تتم معالجة Mirtrons مع نشاط spliceosome بشكل مستقل عن Drosha15. بالنظر إلى التردد العالي لل miRNAs الموجودة داخل الإنترونات ، افترضنا أن البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي المشاركة في الربط يمكن أن تسهل أيضا معالجة ونضج هذه miRNAs. والجدير بالذكر أن RBP hnRNP A2 / B1 قد ارتبط بالفعل بالمعالج الدقيق والتكوين الحيوي miRNA16.

لقد أبلغنا سابقا أن العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، مثل hnRNPs و HuR ، ترتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال الاستبطاني بواسطة مطياف الكتلة17. تم تأكيد ارتباط HuR (ELAVL1) مع miRNAs من الكتلة الإنترونية miR-17-92 باستخدام الترسيب المناعي وفي تحليل سيليكو 9. miR-17-92 هي مجموعة miRNA إنترونية تتكون من ستة miRNAs مع زيادة التعبير في أنواع السرطان المختلفة18,19. تعرف هذه المجموعة أيضا باسم “oncomiR-1” وتتكون من miR-17 و miR-18a و miR-19 a و miR-20 و miR-19 b و miR-92 a. miR-19 a و miR-19b هي من بين أكثر miRNAs ورمية المنشأ في هذه المجموعة 19. زيادة التعبير عن HuR يحفز miR-19a و miR-19b التوليف9. نظرا لأن المناطق الإنترونية المحيطة بهذه المجموعة مرتبطة ب HuR ، فقد طورنا طريقة للتحقيق فيما إذا كان هذا البروتين يمكن أن ينظم تعبير ونضج miR-19a و miR-19b. كان أحد التنبؤات المهمة لفرضيتنا هو أنه ، كبروتين تنظيمي ، يمكن أن يسهل HuR التكوين الحيوي miRNA ، مما يؤدي إلى تغييرات في النمط الظاهري. كان أحد الاحتمالات هو أن miRNAs تمت معالجتها عن طريق تحفيز HuR ولكنها لن تكون ناضجة ووظيفية ، وبالتالي ، فإن آثار البروتين لن تؤثر بشكل مباشر على النمط الظاهري. لذلك ، قمنا بتطوير فحص مراسل الربط للتحقيق فيما إذا كان RBP مثل HuR يمكن أن يؤثر على التكوين الحيوي ونضج miRNA الإنتروني. من خلال تأكيد معالجة miRNA ونضجها ، يظهر فحصنا التفاعل مع التسلسل المستهدف وتوليد miRNA ناضج ووظيفي. في فحصنا ، نقوم بإقران التعبير عن مجموعة miRNA الإنترونية مع بلازميد luciferase للتحقق من وجود ربط مستهدف miRNA في الخلايا المستزرعة.

Protocol

ويرد في الشكل 1 عرض عام للبروتوكول الموصوف هنا. 1. بناء البلازميد pCAGGS-Cre: تم توفير هذا البلازميد من قبل الدكتور E. Makeyev21. pRD-miR-17-92:قم بتضخيم ما قبل miR-17-92 بواسطة PCR باستخدام 0.5 ميكرومتر من كل تمهيدي محدد (جدول المواد</strong…

Representative Results

كانت فرضيتنا الأولية هي أن HuR يمكن أن يسهل التكوين الحيوي miRNA الإنتروني عن طريق الارتباط بتسلسل ما قبل miRNA. وبالتالي ، فإن اتصال تعبير HuR والتكوين الحيوي العنقودي miR-17-92 يمكن أن يشير إلى آلية جديدة تحكم نضج هذه miRNAs. تم تأكيد الإفراط في التعبير عن HuR عند نقل pFLAG-HuR في ثلاثة خطوط خلوية مختلفة: …

Discussion

يعد ربط ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال عملية مهمة لتنظيم التعبير الجيني ، ويمكن أن يؤدي التحكم فيه إلى تأثيرات قوية على تعديلات النمط الظاهري للخلية22,23. يتم نسخ أكثر من 70٪ من miRNAs من الإنترونات في البشر ، وافترضنا أنه يمكن تسهيل معالجتها ونضجها عن طريق …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشعر المؤلفون بالامتنان ل E. Makeyev (جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة) لخلايا HeLa-Cre وبلازميدات pRD-RIPE و pCAGGS-Cre. نشكر إدنا كيمورا وكارولينا بورسيل غويس وجيزيلا راموس ولوسيا روسيتي لوبيز وأنسيلمو موريسكوت على دعمهم.

Materials

Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Tags

Reporter AssayMicroRNA MaturationMammalian CellsRNA-binding ProteinsMicroRNA BiogenesisCell CultureTransfectionLuciferaseHuRMiR-17-92RAB1B3’UTR

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image