Summary

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

Published: June 16, 2022
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Summary

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。

Abstract

マイクロRNA(miRNA)は、真核生物に広く普及している短いRNA分子です。ほとんどのmiRNAはイントロンから転写され、その成熟には核内の異なるRNA結合タンパク質が含まれます。成熟したmiRNAはしばしば遺伝子サイレンシングを媒介し、これは転写後の事象を理解するための重要なツールとなっている。それに加えて、それは遺伝子治療のための有望な方法論として探求することができます。しかしながら、現在、哺乳動物細胞培養物におけるmiRNA発現を評価するための直接的な方法は存在しない。ここでは、標的配列との相互作用の確認を通じてmiRNAの生合成と成熟の決定に役立つ効率的で簡単な方法について説明します。また、このシステムは、一次miRNA(pri-miRNA)転写を高効率かつ低コストで制御することができるドキシサイクリン誘導性プロモーターを用いて、外因性miRNA成熟をその内因性活性から分離することを可能にする。このツールは、別のプラスミド中のRNA結合タンパク質による調節も可能にする。さまざまな異なるmiRNAおよびそれらのそれぞれの標的と共に使用することに加えて、トランスフェクションに順応性がある限り、異なる細胞株に適合させることができる。

Introduction

前駆体mRNAスプライシングは、真核生物1における遺伝子発現調節のための重要なプロセスである。成熟RNA中のイントロンの除去およびエクソンの結合は、スプライソソーム、5つのsnRNA(U1、U2、U4、U5、およびU6)と100以上のタンパク質2,3からなる2メガダルトンリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。スプライシング反応は共転写的に起こり、スプライソソームは、エキソン-イントロン境界およびイントロン4内の保存されたスプライス部位の認識によって導かれて、各新しいイントロンで組み立てられる。異なるイントロンは、スプライソソーム複合体およびその成分の顕著な保存にもかかわらず、異なるスプライシング速度を有する可能性がある。スプライス部位保存の違いに加えて、イントロンおよびエキソンに分布する調節配列は、RNA結合タンパク質(RBP)を誘導し、スプライシングを刺激または抑制することができる5,6。HuRは遍在的に発現するRBPであり、mRNAの安定性を制御する重要な因子である7。我々のグループの以前の結果は、HuRがmiRNAを含むイントロンに結合することができることを示しており、このタンパク質がmiRNAのプロセシングおよび成熟を促進する重要な因子である可能性があり、また、選択的スプライシングアイソフォームの生成につながる可能性があることを示している6,8,9

多くのマイクロRNA(miRNA)はイントロニック配列からコード化されている。いくつかはイントロンの一部ですが、他のものは「ミルトロン」として知られており、イントロン10,11全体によって形成されています。miRNAは短い非コードRNAであり、長さ12から18〜24ヌクレオチドの範囲である。それらの成熟配列は、mRNA中の標的配列と部分的または全体的な相補性を示し、したがって、翻訳および/またはmRNAの崩壊速度に影響を及ぼす。miRNAと標的の組み合わせは、細胞を異なる結果に駆り立てます。いくつかのmiRNAは、細胞をプロ腫瘍性または抗腫瘍性表現型に駆動することができる13。発癌性miRNAは通常、抑制特性を誘発するmRNAを標的とし、細胞増殖、遊走、および浸潤の増加をもたらす14。一方、腫瘍抑制性miRNAは、発癌性mRNAまたは細胞増殖の増加に関連するmRNAを標的とする可能性がある。

miRNAのプロセシングと成熟は、その起源にも依存します。ほとんどのイントロニックmiRNAは、リボヌクレアーゼDroshaおよびタンパク質補因子12によって形成されるマイクロプロセッサの関与により処理される。ミルトロンは、Drosha15とは無関係にスプライソソームの活性で処理される。イントロン内で見出されるmiRNAの頻度が高いことを考慮して、我々は、スプライシングに関与するRNA結合タンパク質もこれらのmiRNAの処理および成熟を促進する可能性があるという仮説を立てた。特に、RBP hnRNP A2/B1は、マイクロプロセッサおよびmiRNA生合成16と既に関連している。

我々は以前、質量分析によって、hnRNPやHuRなどのいくつかのRNA結合タンパク質がイントロニックmiRNAと関連していることを報告している17miR-17-92イントロニッククラスターからのmiRNAとのHuR(ELAVL1)の関連は、免疫沈降およびインシリコ分析9を用いて確認された。miR-17-92は、異なる癌において発現が増加した6つのmiRNAからなるイントロニックmiRNAクラスターである1819。このクラスターは「oncomiR-1」としても知られており、miR-17、miR-18 a、miR-19a、miR-20、miR-19 b、およびmiR-92 aから構成されており、miR-19 aおよびmiR-19bはこのクラスター19の中で最も発癌性の高いmiRNAの1つです。 HuRの発現増加は、miR-19aおよびmiR-19b合成を刺激する9 このクラスターに隣接するイントロニック領域はHuRと関連していることから、このタンパク質がmiR-19aおよびmiR-19bの発現と成熟を調節できるかどうかを調べる方法を開発しました。我々の仮説の重要な予測の1つは、調節タンパク質として、HuRがmiRNAの生合成を促進し、表現型の変化をもたらす可能性があるということでした。1つの可能性は、miRNAはHuRの刺激によって処理されるが、成熟して機能的ではないため、タンパク質の効果が表現型に直接影響しないことであった。そこで、HuRなどのRBPがイントロニックmiRNAの生合成と成熟に影響を与えるかどうかを調べるスプライシングレポーターアッセイを開発しました。miRNAのプロセシングと成熟を確認することにより、私たちのアッセイは、標的配列との相互作用と成熟した機能的なmiRNAの生成を示しています。私たちのアッセイでは、イントロニックmiRNAクラスターの発現をルシフェラーゼプラスミドと結合させて、培養細胞におけるmiRNA標的結合をチェックします。

Protocol

ここで説明するプロトコルの概要を 図 1 に示します。 1. プラスミド構築 pCAGGS-Cre:このプラスミドは、E. Makeyev21博士によって提供された。 pRD-miR-17-92:0.5 μM の各特異的プライマー(材料表)、150 ng の cDNA、1 mM の dNTP、1x Taq PCR バッファー、および 5 U の高忠実度 Taq DNA ポリメラーゼを使用?…

Representative Results

私たちの最初の仮説は、HuRがそのプレmiRNA配列に結合することによってイントロニックmiRNA生合成を促進することができるということでした。したがって、HuR発現と miR-17-92クラスター生合成の関連は、これらのmiRNAの成熟を支配する新しいメカニズムを指し示す可能性がある。pFLAG-HuRのトランスフェクション時のHuRの過剰発現は、HeLa、BCPAP、およびHEK-293Tの3つの異なる細胞株で確認され…

Discussion

プレmRNAスプライシングは遺伝子発現調節のための重要なプロセスであり、その制御は細胞表現型改変に強い効果を引き起こす可能性がある2223。miRNAの70%以上がヒトのイントロンから転写されており、我々は、調節タンパク質をスプライシングすることによって、それらのプロセシングと成熟を促進することができるという仮説を立てた<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、HeLa-Cre細胞およびpRD-RIPEおよびpCAGGS-Creプラスミドについて、E. Makeyev(シンガポール南洋理工大学)に感謝している。エドナ・キムラ、カロライナ・パーセル・ゴーズ、ヒセラ・ラモス、ルシア・ロセッティ・ロペス、アンセルモ・モリスコットのサポートに感謝します。

Materials

Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

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Cite This Article
Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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