Summary

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l’espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA corte che sono diffuse negli eucarioti. La maggior parte dei miRNA sono trascritti da introni e la loro maturazione coinvolge diverse proteine leganti l’RNA nel nucleo. I miRNA maturi mediano frequentemente il silenziamento genico, e questo è diventato uno strumento importante per comprendere gli eventi post-trascrizionali. Oltre a ciò, può essere esplorato come una metodologia promettente per le terapie geniche. Tuttavia, attualmente mancano metodi diretti per valutare l’espressione dei miRNA nelle colture cellulari di mammifero. Qui, descriviamo un metodo efficiente e semplice che aiuta a determinare la biogenesi e la maturazione dei miRNA attraverso la conferma della sua interazione con le sequenze bersaglio. Inoltre, questo sistema consente la separazione della maturazione dei miRNA esogeni dalla sua attività endogena utilizzando un promotore inducibile dalla doxiciclina in grado di controllare la trascrizione primaria dei miRNA (pri-miRNA) con alta efficienza e basso costo. Questo strumento consente anche la modulazione con proteine leganti l’RNA in un plasmide separato. Oltre al suo uso con una varietà di miRNA diversi e i loro rispettivi bersagli, può essere adattato a diverse linee cellulari, a condizione che queste siano suscettibili di trasfezione.

Introduction

Lo splicing dell’mRNA precursore è un processo importante per la regolazione dell’espressione genica negli eucarioti1. La rimozione degli introni e l’unione degli esoni nell’RNA maturo è catalizzata dallo spliceosoma, un complesso ribonucleoproteico di 2 megadalton composto da 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 e U6) insieme a più di 100 proteine 2,3. La reazione di splicing avviene co-trascrizionalmente e lo spliceosoma viene assemblato ad ogni nuovo introne guidato dal riconoscimento dei siti di giunzione conservati ai confini dell’esone-introne e all’interno dell’introne4. Introni diversi potrebbero avere velocità di splicing diverse nonostante la notevole conservazione del complesso dello spliceosoma e dei suoi componenti. Oltre alle differenze nella conservazione del sito di splicing, le sequenze regolatorie distribuite su introni ed esoni possono guidare le proteine leganti l’RNA (RBP) e stimolare o reprimere lo splicing 5,6. HuR è un RBP espresso ubiquitariamente ed è un fattore importante per controllare la stabilità dell’mRNA7. I risultati precedenti del nostro gruppo hanno mostrato che HuR può legarsi agli introni contenenti miRNA, indicando che questa proteina potrebbe essere un fattore importante per facilitare l’elaborazione e la maturazione dei miRNA, portando anche alla generazione di isoforme di splicing alternative 6,8,9.

Molti microRNA (miRNA) sono codificati da sequenze introniche. Mentre alcuni fanno parte dell’introne, altri sono noti come “mirtron” e sono formati dall’intero introne10,11. I miRNA sono brevi RNA non codificanti, che vanno da 18 a 24 nucleotidi di lunghezza12. La loro sequenza matura mostra una complementarità parziale o totale con le sequenze bersaglio negli mRNA, influenzando quindi i tassi di traduzione e/o di decadimento dell’mRNA. Le combinazioni di miRNA e bersagli guidano la cellula verso risultati diversi. Diversi miRNA possono guidare le cellule verso fenotipi pro- o anti-tumorali13. I miRNA oncogeni di solito prendono di mira gli mRNA che innescano una caratteristica soppressiva, portando ad un aumento della proliferazione cellulare, della migrazione e dell’invasione14. D’altra parte, i miRNA soppressivi del tumore potrebbero colpire mRNA oncogeni o mRNA correlati all’aumento della proliferazione cellulare.

Anche l’elaborazione e la maturazione dei miRNA dipendono dalla loro origine. La maggior parte dei miRNA intronici vengono elaborati con la partecipazione del microprocessore, formato dalla ribonucleasi Drosha e dai cofattori proteici12. I mirtroni vengono elaborati con l’attività dello spliceosoma indipendentemente da Drosha15. Considerando l’alta frequenza di miRNA presenti all’interno degli introni, abbiamo ipotizzato che le proteine leganti l’RNA coinvolte nello splicing potrebbero anche facilitare l’elaborazione e la maturazione di questi miRNA. In particolare, l’hnRNP RBP A2/B1 è già stato associato al microprocessore e alla biogenesi16 del miRNA.

Abbiamo precedentemente riportato che diverse proteine leganti l’RNA, come hnRNPs e HuR, sono associate a miRNA intronici dalla spettrometria di massa17. L’associazione di HuR (ELAVL1) con i miRNA del cluster intronico miR-17-92 è stata confermata utilizzando l’immunoprecipitazione e l’analisi in silico 9. miR-17-92 è un cluster di miRNA intronico composto da sei miRNA con aumentata espressione in diversi tumori18,19. Questo cluster è anche noto come “oncomiR-1” ed è composto da miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b e miR-92 a. miR-19 a e miR-19b sono tra i miRNA più oncogeni di questo cluster 19. L’aumentata espressione di HuR stimola la sintesi di miR-19a e miR-19b 9. Poiché le regioni introniche che fiancheggiano questo cluster sono associate a HuR, abbiamo sviluppato un metodo per indagare se questa proteina potesse regolare l’espressione e la maturazione di miR-19a e miR-19b. Una previsione importante della nostra ipotesi era che, come proteina regolatrice, HuR potrebbe facilitare la biogenesi dei miRNA, portando ad alterazioni fenotipiche. Una possibilità era che i miRNA fossero processati dalla stimolazione di HuR ma non fossero maturi e funzionali e, quindi, gli effetti della proteina non avrebbero avuto un impatto diretto sul fenotipo. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio di splicing reporter per indagare se un RBP come HuR potrebbe influenzare la biogenesi e la maturazione di un miRNA intronico. Confermando l’elaborazione e la maturazione dei miRNA, il nostro test mostra l’interazione con la sequenza target e la generazione di un miRNA maturo e funzionale. Nel nostro test, abbiamo accoppiato l’espressione di un cluster di miRNA intronico con un plasmide di luciferasi per verificare il legame del bersaglio dei miRNA nelle cellule in coltura.

Protocol

Una panoramica del protocollo qui descritto è illustrata nella Figura 1. 1. Costruzione plasmidica pCAGGS-Cre: Questo plasmide è stato fornito dal Dr. E. Makeyev21. pRD-miR-17-92:Amplificare pre-miR-17-92 mediante PCR utilizzando 0,5 μM di ciascun primer specifico (Table of Materials), 150 ng di cDNA, 1 mM dNTPs, 1x tampone Taq PCR e 5 U di Taq DNA polimerasi ad alta …

Representative Results

La nostra ipotesi iniziale era che HuR potesse facilitare la biogenesi dei miRNA intronici legandosi alla sua sequenza pre-miRNA. Pertanto, la connessione tra l’espressione di HuR e la biogenesi del cluster miR-17-92 potrebbe indicare un nuovo meccanismo che governa la maturazione di questi miRNA. La sovraespressione di HuR dopo trasfezione di pFLAG-HuR è stata confermata in tre diverse linee cellulari: HeLa, BCPAP e HEK-293T (Figura 2). Come controlli, sono state utilizzate cellul…

Discussion

Lo splicing pre-mRNA è un processo importante per la regolazione dell’espressione genica e il suo controllo può innescare forti effetti sulle modificazioni fenotipiche cellulari22,23. Più del 70% dei miRNA sono trascritti da introni nell’uomo, e abbiamo ipotizzato che la loro elaborazione e maturazione potrebbe essere facilitata dallo splicing delle proteine regolatrici24,25. Abbiamo sviluppato un meto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati a E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) per le cellule HeLa-Cre e i plasmidi pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Ringraziamo Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot per il loro supporto.

Materials

Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

References

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Cite This Article
Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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