Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Summary

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Abstract

Les microARN (miARN) sont des molécules d’ARN courtes qui sont répandues chez les eucaryotes. La plupart des miARN sont transcrits à partir d’introns, et leur maturation implique différentes protéines de liaison à l’ARN dans le noyau. Les miARN matures interviennent fréquemment dans le silençage génique, ce qui est devenu un outil important pour comprendre les événements post-transcriptionnels. En outre, il peut être exploré comme une méthodologie prometteuse pour les thérapies géniques. Cependant, il existe actuellement un manque de méthodes directes pour évaluer l’expression des miARN dans les cultures de cellules de mammifères. Ici, nous décrivons une méthode efficace et simple qui aide à déterminer la biogenèse et la maturation des miARN en confirmant son interaction avec les séquences cibles. En outre, ce système permet de séparer la maturation exogène du miARN de son activité endogène à l’aide d’un promoteur inductible par la doxycycline capable de contrôler la transcription primaire des miARN (pri-miARN) avec une efficacité élevée et un faible coût. Cet outil permet également la modulation avec des protéines de liaison à l’ARN dans un plasmide séparé. En plus de son utilisation avec une variété de miARN différents et leurs cibles respectives, il peut être adapté à différentes lignées cellulaires, à condition que celles-ci se prêtent à la transfection.

Introduction

L’épissage précurseur de l’ARNm est un processus important pour la régulation de l’expression génique chez les eucaryotes¹. L’élimination des introns et l’union des exons dans l’ARN mature sont catalysées par le spliceosome, un complexe ribonucléoprotéique de 2 mégadaltons composé de 5 ARNn (U1, U2, U4, U5 et U6) ainsi que de plus de 100 protéines ^2,3. La réaction d’épissage se produit co-transcriptionnellement, et le splicéosome est assemblé à chaque nouvel intron guidé par la reconnaissance des sites d’épissage conservés aux limites exon-intron et à l’intérieur de l’intron⁴. Différents introns peuvent avoir des taux d’épissage différents malgré la conservation remarquable du complexe spliceosome et de ses composants. En plus des différences dans la conservation du site d’épissage, les séquences régulatrices réparties sur les introns et les exons peuvent guider les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et stimuler ou réprimer l’épissage ^5,6. HuR est un RBP omniprésent et est un facteur important pour contrôler la stabilité de l’ARNm⁷. Les résultats antérieurs de notre groupe ont montré que HuR peut se lier aux introns contenant des miARN, ce qui indique que cette protéine pourrait être un facteur important pour faciliter le traitement et la maturation des miARN, conduisant également à la génération d’isoformes d’épissage alternatives ^6,8,9.

De nombreux microARN (miARN) sont codés à partir de séquences introniques. Alors que certains font partie de l’intron, d’autres sont connus sous le nom de « mirtrons » et sont formés par l’intron entier^10,11. Les miARN sont de courts ARN non codants, allant de 18 à 24 nucléotides de longueur¹². Leur séquence mature montre une complémentarité partielle ou totale avec les séquences cibles dans les ARNm, affectant ainsi les taux de translation et/ou de désintégration de l’ARNm. Les combinaisons de miARN et de cibles conduisent la cellule à des résultats différents. Plusieurs miARN peuvent conduire les cellules à des phénotypes pro- ou anti-tumoraux¹³. Les miARN oncogènes ciblent généralement les ARNm qui déclenchent une caractéristique suppressive, entraînant une augmentation de la prolifération, de la migration et de l’invasion^{cellulaires 14}. D’autre part, les miARN suppresseurs de tumeurs pourraient cibler les ARNm oncogènes ou les ARNm liés à une prolifération cellulaire accrue.

Le traitement et la maturation des miARN dépendent également de leur origine. La plupart des miARN introniques sont traités avec la participation du microprocesseur, formé par la ribonucléase Drosha et les cofacteurs protéiques¹². Les mirtrons sont traités avec l’activité du spliceosome indépendamment de Drosha¹⁵. Compte tenu de la fréquence élevée des miARN trouvés dans les introns, nous avons émis l’hypothèse que les protéines de liaison à l’ARN impliquées dans l’épissage pourraient également faciliter le traitement et la maturation de ces miARN. Notamment, le RBP hnRNP A2/B1 a déjà été associé au microprocesseur et à la biogenèse^{miARN 16}.

Nous avons déjà signalé que plusieurs protéines de liaison à l’ARN, telles que hnRNP et HuR, sont associées aux miARN introniques par spectrométrie^{de masse 17}. L’association de HuR (ELAVL1) avec les miARN de l’amas intronique miR-17-92 a été confirmée par immunoprécipitation et analyse in silico ⁹. miR-17-92 est un amas de miARN introniques composé de six miARN avec une expression accrue dans différents cancers^18,19. Ce groupe est également connu sous le nom de « oncomiR-1 » et est composé de miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b et miR-92 a. miR-19 a et miR-19b sont parmi les miARN les plus oncogènes de ce groupe 19. L’expression accrue de HuR stimule la synthèse miR-19a et miR-19b ⁹. Étant donné que les régions introniques flanquant ce groupe sont associées à HuR, nous avons développé une méthode pour déterminer si cette protéine pouvait réguler l’expression et la maturation de miR-19a et miR-19b. Une prédiction importante de notre hypothèse était que, en tant que protéine régulatrice, HuR pourrait faciliter la biogenèse des miARN, conduisant à des altérations phénotypiques. Une possibilité était que les miARN étaient traités par la stimulation de HuR mais ne seraient pas matures et fonctionnels et, par conséquent, les effets de la protéine n’auraient pas d’impact direct sur le phénotype. Par conséquent, nous avons développé un test de rapporteur d’épissage pour déterminer si une RBP telle que HuR pouvait affecter la biogenèse et la maturation d’un miARN intronique. En confirmant le traitement et la maturation des miARN, notre test montre l’interaction avec la séquence cible et la génération d’un miARN mature et fonctionnel. Dans notre essai, nous couplons l’expression d’un groupe de miARN intronique avec un plasmide luciférase pour vérifier la liaison à la cible du miARN dans les cellules en culture.

Protocol

Une vue d’ensemble du protocole décrit ici est illustrée à la figure 1. 1. Construction plasmidique pCAGGS-Cre: Ce plasmide a été fourni par le Dr E. Makeyev21. pRD-miR-17-92:Amplifier le pré-miR-17-92 par PCR en utilisant 0,5 μM de chaque amorce spécifique (Tableau des matériaux), 150 ng d’ADNc, 1 mM de dNTP, 1x tampon Taq PCR et 5 U d’ADN polymérase Taq…

Representative Results

Notre hypothèse initiale était que HuR pourrait faciliter la biogenèse intronique des miARN en se liant à sa séquence pré-miARN. Ainsi, la connexion de l’expression de HuR et de la biogenèse des amas miR-17-92 pourrait indiquer un nouveau mécanisme régissant la maturation de ces miARN. La surexpression de HuR lors de la transfection de pFLAG-HuR a été confirmée dans trois lignées cellulaires différentes : HeLa, BCPAP et HEK-293T (Figure 2). Comme témoins, des cellul…

Discussion

L’épissage pré-ARNm est un processus important pour la régulation de l’expression génique, et son contrôle peut déclencher de forts effets sur les modifications phénotypiques cellulaires^22,23. Plus de 70% des miARN sont transcrits à partir d’introns chez l’homme, et nous avons émis l’hypothèse que leur traitement et leur maturation pourraient être facilités par l’épissage des protéines régulatrices^{24,25</sup…}

Materials

Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid)			A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR			Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB			Generated during this work
pmiRGLO-scrambled			Generated during this work
pRD-miR-17-92			Generated during this work
pRD-RIPE-donor			A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla	Promega	E2241
Antibodies
anti-B-actin	Sigma Aldrich	A5316
anti-HuR	Cell Signaling	mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG	Li-Cor Biosciences	926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG	Li-Cor Biosciences	929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre			A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92			Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR			Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc			Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc			Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled			Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose	Thermo Fisher Scientific	12800-017
Doxycycline	BioBasic	MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2940
EcoRI	Thermo Fisher Scientific	ER0271
EcoRV	Thermo Fisher Scientific	ER0301
Geneticin	Thermo Fisher Scientific	E859-EG
L-glutamine	Life Technologies
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector	Sigma Aldrich	E6783
pGEM-T	Promega	A3600
Platinum Taq DNA polymerase	Thermo Fisher Scientific	10966-030
pmiR-GLO	Promega	E1330
Puromycin	Sigma Aldrich	P8833
RNAse OUT	Thermo Fisher Scientific	752899
SuperScript IV kit	Thermo Fisher Scientific	18091050
Trizol-LS reagent	Thermo Fisher	10296-028
trypsin/EDTA 10X	Life Technologies	15400-054
XbaI	Thermo Fisher Scientific	10131035
XhoI	Promega	R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO	Exxtend	TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO	Exxtend	CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO	Exxtend	TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO	Exxtend	CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG	Exxtend	GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG	Exxtend	GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE	Exxtend	ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE	Exxtend	ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B)	Exxtend	CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B)	Exxtend	GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR	Exxtend	ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR	Exxtend	CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR	Exxtend	ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR	Exxtend	CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR	Exxtend	GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR	Exxtend	TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X	Graphpad	https://www.graphpad.com
ImageJ	National Institutes of Health	http://imagej.nih.gov/ij