Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen
Summary
Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kurze RNA-Moleküle, die in Eukaryoten weit verbreitet sind. Die meisten miRNAs werden von Introns transkribiert, und ihre Reifung umfasst verschiedene RNA-bindende Proteine im Zellkern. Reife miRNAs vermitteln häufig Gen-Silencing, und dies ist zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um posttranskriptionelle Ereignisse zu verstehen. Darüber hinaus kann es als vielversprechende Methodik für Gentherapien erforscht werden. Derzeit fehlen jedoch direkte Methoden zur Beurteilung der miRNA-Expression in Säugetierzellkulturen. Hier beschreiben wir eine effiziente und einfache Methode, die bei der Bestimmung der miRNA-Biogenese und -Reifung durch Bestätigung ihrer Interaktion mit Zielsequenzen hilft. Dieses System ermöglicht auch die Trennung der exogenen miRNA-Reifung von ihrer endogenen Aktivität unter Verwendung eines Doxycyclin-induzierbaren Promotors, der in der Lage ist, die primäre miRNA (pri-miRNA) -Transkription mit hoher Effizienz und niedrigen Kosten zu steuern. Dieses Werkzeug ermöglicht auch die Modulation mit RNA-bindenden Proteinen in einem separaten Plasmid. Neben der Verwendung mit einer Vielzahl verschiedener miRNAs und ihren jeweiligen Targets kann es an verschiedene Zelllinien angepasst werden, sofern diese transfektionsfähig sind.
Introduction
Das Vorläufer-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten1. Die Entfernung von Introns und die Vereinigung von Exons in reifer RNA wird durch das Spleißosom katalysiert, einen 2-Megadalton-Ribonukleoproteinkomplex, der aus 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 und U6) zusammen mit mehr als 100 Proteinen 2,3 besteht. Die Spleißreaktion erfolgt kotranskriptionell, und das Spleißosom wird an jedem neuen Intron zusammengesetzt, geleitet durch die Erkennung konservierter Spleißstellen an Exon-Intron-Grenzen und innerhalb des Introns4. Verschiedene Introns können trotz der bemerkenswerten Erhaltung des Spleißosomenkomplexes und seiner Komponenten unterschiedliche Spleißraten aufweisen. Zusätzlich zu den Unterschieden in der Konservierung von Spleißstellen können regulatorische Sequenzen, die auf Introns und Exons verteilt sind, RNA-bindende Proteine (RBP) steuern und das Spleißen stimulieren oder unterdrücken 5,6. HuR ist ein ubiquitär exprimiertes RBP und ein wichtiger Faktor zur Kontrolle der mRNA-Stabilität7. Frühere Ergebnisse unserer Gruppe zeigten, dass HuR an Introns binden kann, die miRNAs enthalten, was darauf hindeutet, dass dieses Protein ein wichtiger Faktor sein könnte, um die miRNA-Verarbeitung und -Reifung zu erleichtern, was auch zur Erzeugung alternativer Spleißisoformenführt 6,8,9.
Viele microRNAs (miRNAs) werden aus intronischen Sequenzen kodiert. Während einige Teil des Introns sind, sind andere als “Mirtrons” bekannt und werden vom gesamten Intron10,11 gebildet. miRNAs sind kurze nicht-kodierende RNAs mit 18 bis 24 Nukleotiden der Länge12. Ihre ausgereifte Sequenz zeigt eine teilweise oder vollständige Komplementarität mit Zielsequenzen in mRNAs, was sich auf die Translations- und/oder mRNA-Zerfallsraten auswirkt. Die Kombinationen von miRNAs und Targets treiben die Zelle zu unterschiedlichen Ergebnissen. Mehrere miRNAs können Zellen zu pro- oder antitumoralen Phänotypen treiben13. Onkogene miRNAs zielen in der Regel auf mRNAs ab, die eine suppressive Eigenschaft auslösen, was zu einer erhöhten Zellproliferation, Migration und Invasion führt14. Auf der anderen Seite könnten tumorsuppressive miRNAs auf onkogene mRNAs oder mRNAs abzielen, die mit einer erhöhten Zellproliferation zusammenhängen.
Auch die Verarbeitung und Reifung von miRNAs hängt von ihrer Herkunft ab. Die meisten intronischen miRNAs werden unter Beteiligung des Mikroprozessors verarbeitet, der aus der Ribonuklease Drosha und den Protein-Cofaktoren12 besteht. Mirtrons werden mit der Aktivität des Spleißosoms unabhängig von Drosha15 verarbeitet. In Anbetracht der hohen Häufigkeit von miRNAs, die in Introns gefunden werden, stellten wir die Hypothese auf, dass RNA-bindende Proteine, die am Spleißen beteiligt sind, auch die Verarbeitung und Reifung dieser miRNAs erleichtern könnten. Bemerkenswerterweise wurde das RBP hnRNP A2/B1 bereits mit dem Mikroprozessor und der miRNA-Biogeneseassoziiert 16.
Wir haben bereits berichtet, dass mehrere RNA-bindende Proteine, wie hnRNPs und HuR, durch Massenspektrometrie mit intronischen miRNAs assoziiert sind17. Die Assoziation von HuR (ELAVL1) mit miRNAs aus dem intronischen Cluster miR-17-92 wurde mittels Immunpräzipitation und In-silico-Analyse bestätigt9. miR-17-92 ist ein intronischer miRNA-Cluster, der aus sechs miRNAs mit erhöhter Expression bei verschiedenen Krebsarten besteht18,19. Dieser Cluster wird auch als “oncomiR-1” bezeichnet und besteht aus miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b und miR-92 a. miR-19 a und miR-19b gehören zu den onkogensten miRNAs dieses Clusters 19. Die erhöhte Expression von HuR stimuliert die miR-19a- und miR-19b-Synthese 9. Da intronische Regionen, die diesen Cluster flankieren, mit HuR assoziiert sind, haben wir eine Methode entwickelt, um zu untersuchen, ob dieses Protein die Expression und Reifung von miR-19a und miR-19b regulieren kann. Eine wichtige Vorhersage unserer Hypothese war, dass HuR als regulatorisches Protein die miRNA-Biogenese erleichtern könnte, was zu phänotypischen Veränderungen führt. Eine Möglichkeit war, dass miRNAs durch die Stimulation von HuR verarbeitet wurden, aber nicht ausgereift und funktionsfähig wären und daher die Auswirkungen des Proteins den Phänotyp nicht direkt beeinflussen würden. Daher haben wir einen Spleißreporter-Assay entwickelt, um zu untersuchen, ob ein RBP wie HuR die Biogenese und Reifung einer intronischen miRNA beeinflussen könnte. Durch die Bestätigung der miRNA-Prozessierung und -Reifung zeigt unser Assay die Interaktion mit der Zielsequenz und die Erzeugung einer reifen und funktionellen miRNA. In unserem Assay koppeln wir die Expression eines intronischen miRNA-Clusters mit einem Luciferase-Plasmid, um die miRNA-Target-Bindung in kultivierten Zellen zu überprüfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Pre-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression, und seine Kontrolle kann starke Auswirkungen auf die phänotypischen Modifikationen der Zellen auslösen22,23. Mehr als 70% der miRNAs werden von Introns beim Menschen transkribiert, und wir stellten die Hypothese auf, dass ihre Verarbeitung und Reifung durch Spleißen regulatorischer Proteine erleichtert werden könnte24,25…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapur) für die HeLa-Cre-Zellen und pRD-RIPE- und pCAGGS-Cre-Plasmide. Wir danken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes und Anselmo Moriscot für ihre Unterstützung.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
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| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
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| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
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| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
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| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
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| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
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| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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