Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H’den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.
Canlı bir tümör mikroortamında çok sayıda hücre tipi ve hücre dışı matriks (ECM) arasındaki karmaşık ve dinamik fizyolojik etkileşimleri görselleştirme yeteneği, tümör progresyonunu düzenleyen mekanizmaları anlamak için önemli bir adımdır. Bu, mevcut intravital görüntüleme teknikleriyle gerçekleştirilebilse de, dokuların heterojen doğası ve deneysel gözlem içindeki mekansal bağlama duyulan ihtiyaç nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, kollajen ikinci harmonik jenerasyon görüntülemeyi, metabolik ko-faktör NAD(P)H’den endojen floresanı ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunu (FLIM) tümör mikroçevresini tümör yuvasının, çevresindeki stroma veya ECM’nin ve vaskülatürün temel alanlarına invaziv olmayan bir şekilde bölümlere ayırmak için bir araç olarak eşleştiren intravital bir görüntüleme iş akışı geliştirdik. Bu non-invaziv protokol, meme tümörü modellerinin hızlandırılmış görüntülerinin elde edilmesinden işlem sonrası analiz ve görüntü segmentasyonuna kadar uzanan adım adım süreci detaylandırır. Bu iş akışının birincil avantajı, eksojen floresan etiketler kullanmadan dinamik olarak değişen canlı tümör mikro ortamını bağlamsallaştırmak için metabolik imzalardan yararlanmasıdır, bu da onu insan kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri ve dışsal floroforların kolayca uygulanamadığı gelecekteki klinik kullanım için avantajlı hale getirir.
Tümör mikroortamındaki hücre dışı matriksin (ECM), hastalığın ilerlemesini daha da kolaylaştırmak için çoklu hücre tipleri tarafından dinamik olarak biriktirildiği ve yeniden şekillendirildiği bilinmektedir 1,2,3. Bu matris değişiklikleri, hücre davranışını değiştiren ve sıklıkla matris yeniden şekillenmesinin devam eden bir döngüsüyle sonuçlanan hem mekanik hem de biyolojik ipuçları sağlar4. Tümör hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki dinamik, karşılıklı etkileşimin araştırılması genellikle üç boyutlu (3D) in vitro kültür veya mikroakışkan sistemler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu aşağıdan yukarıya yaklaşımlar ECM yeniden şekillenme mekanizmalarını göstermiş olsa da 5,6,7, artmış proliferasyon8, epitelden mezenkimal geçişegeçiş 9,10,11,12 ve tümör hücresi migrasyonu ve invazyonu 7,13,14,15,16 , odak noktaları öncelikle fizyolojik bir doku içinde bulunan etkileşimlerin çeşitliliği ve heterojenliği ile karşılaştırıldığında homojen bir 3D matris içindeki birkaç hücre tipi (örneğin, tümör hücreleri veya fibroblastlar) üzerinde olmuştur. İn vitro sistemlere ek olarak, ex vivo tümör histolojisi de bu hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri hakkında bazı bilgiler sağlayabilir17. İmmünohistokimya, ECM’nin mekansal olarak heterojen bileşimi ve mimarisi açısından çoklu hücre tiplerini analiz edebilme avantajına sahiptir, ancak sabit dokunun statik sonlanım noktaları, hücreler ve mikroçevre arasındaki etkileşimlerin dinamik doğasını yakalamaz. İntravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin fizyolojik bağlamı içinde çeşitli ve dinamik etkileşimleri sorgulamak için kapıyı açmıştır.
İntravital tümör görüntülemenin yetenekleri hızla ilerlemektedir. Görüntüleme pencerelerinin tasarımındaki gelişmeler ve pencereleri implante etmek için cerrahi teknikler, çeşitli anatomik lokalizasyonlarda (yani primer tümör, lenf nodları, metastatik bölgeler18,19,20) uzun süreli uzunlamasına tümör görüntülemesini mümkün kılmıştır. Dahası, optik enstrümantasyonun çoklu boyutlarda (yani spektral, uzamsal floresan yoğunluğu ve kullanım ömrü) ve yüksek çözünürlükte ve hızda (video hızı) verileri görselleştirme ve toplama kapasitesi yaygın olarak erişilebilir hale gelmektedir. Gelişmiş teknoloji, fizyolojik bir ortamda hücre sinyalizasyonundaki ve fenotipik dinamiklerdeki hızlı değişiklikleri keşfetme fırsatı sunar. Son olarak, optogenetik araçların genişlemesi ve çok çeşitli genetik floresan yapılar, tümör mikro ortamında hücre göçünü yakalamak için spesifik hücre tiplerinin etiketlenmesine veya gelişim veya hastalık ilerlemesi sırasında hücre soyu izlemesine izin verir21,22. Bu araçların CRISPR / Cas9 teknolojisi ile birlikte kullanılması, araştırmacılara zamanında benzersiz hayvan modelleri oluşturma fırsatı sunar.
Tüm bu ilerlemeler, intravital görüntülemeyi dinamik ve fizyolojik hücresel etkileşimleri keşfetmek için giderek daha güçlü bir yöntem haline getirirken, bu biyolojik etkileşimlere doku düzeyinde mekansal, zamansal ve yapısal bağlam sağlayan stratejiler geliştirmeye hala önemli bir ihtiyaç vardır. Şu anda, birçok intravital görüntüleme çalışması, vaskülatüre floresan boyalar enjekte ederek veya fiziksel özellikleri tanımlamak için floresan proteinleri dışsal olarak eksprese eden fare modellerini kullanarak kan damarları gibi görsel işaretlerin eksikliğini telafi etmektedir. Enjekte edilebilir boyalar ve floresan dekstrans gibi substratlar, intravital koleksiyonlarda vaskülatürü başarılı bir şekilde etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır19, 23, 24. Ancak, bu yaklaşım sınırlama olmaksızın değildir. Birincisi, ek fare manipülasyonları gerektirir ve faydası kısa vadeli deneylerle sınırlıdır. Uzunlamasına çalışmalar için, fagositik hücrelerde dekstran birikimini veya zamanla çevre dokuya difüzyonu gözlemlediğimiz için floresan dekstran sorunlu olabilir25. Fare modeline eksojen floresan protein katılımı, floresan dekstransa alternatif olarak sunulmuştur, ancak kendi sınırlamalarını sunmaktadır. Fare modellerindeki eksojen floroforların mevcudiyeti ve çeşitliliği hala sınırlı ve oluşturulması pahalıdır. Ek olarak, PDX modelleri gibi belirli modellerde, genetik manipülasyonlar arzu edilmez veya mümkün değildir. Ayrıca, hücrelerdeki floresan veya biyolüminesan proteinlerin varlığının fare içinde yabancı olarak kabul edildiği ve immünokompetan fare modellerinde, bunun konakçı bağışıklık sisteminin tepkisine bağlı metastaz miktarını azalttığı gösterilmiştir26,27. Son olarak, uzamsal bağlam için veya sonraki verileri segmentlere ayırmak için kullanılan eksojen floresan proteinler veya floresan boyalar, genellikle ilginin fizyolojik etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilecek ışık spektrumunun asal aralıklarını işgal eder.
ECM’den gelen içsel sinyalin veya doku içindeki hücrelerden endojen floresanın kullanılması, daha derinlemesine hücresel ve mekansal analiz için intravital verileri segmentlere ayırmak için potansiyel bir evrensel etiketsiz aracı temsil eder. İkinci harmonik jenerasyon (SHG), ECM28’i görselleştirmek için uzun zamandır kullanılmaktadır. Daha sonra fiber organizasyonu 29,30,31’in karakterizasyonuna yardımcı olacak önemli araçların geliştirilmesiyle, yerel ECM yapısına göre hücre davranışını karakterize etmek mümkündür. Ek olarak, endojen metabolitten gelen otofloresan olan NAD (P) H, tümör mikro ortamını in vivo olarak bölümlere ayırmak için başka bir etiketsiz araç sağlar. NAD (P) H, tümör hücrelerinde parlak bir şekilde flüoresan eder ve büyüyen tümör yuvasının sınırlarını çevresindeki stroma21,32’den ayırt etmek için kullanılabilir. Son olarak, vaskülatür, tümör mikroortamında ve anahtar hücre tipine özgü etkileşimlerin yapıldığı yerde önemli bir fizyolojik yapıdır33,34,35. Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) veya kan plazmasının uyarılması, tümör vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılmıştır ve iki veya üç foton uyarımı (2P; 3P) kullanılarak kan akış hızlarının ölçülmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir36. Bununla birlikte, daha büyük kan damarları endojen floresan imzaları ile kolayca tanımlanabilirken, ince, değişken ve daha az floresan küçük kan damarlarının tanımlanması daha fazla uzmanlık gerektirir. Bu doğal zorluklar optimum görüntü segmentasyonunu engeller. Neyse ki, bu endojen floresan kaynakları (yani, kırmızı kan hücreleri ve kan plazması), vaskülatürün benzersiz fotofiziksel özelliklerinden yararlanan ve büyüyen intravital alet kutusuna yararlı bir katkı sağlayan floresan ömür boyu görüntüleme37 ile de ölçülebilir.
Bu protokolde, endojen floresan ve SHG gibi içsel sinyalleri açıkça kullanarak dört boyutlu (4D) intravital görüntülemenin segmentasyonu için bir iş akışı, edinimden analize kadar tanımlanmıştır. Bu protokol, PDX modellerinde olduğu gibi, eksojen floresanın pratik veya mümkün olmayabileceği bir meme görüntüleme penceresinden geçen uzunlamasına çalışmalar için özellikle uygundur. Bununla birlikte, burada özetlenen segmentasyon ilkeleri, tümör biyolojisini, doku gelişimini ve hatta normal doku fizyolojisini araştıran intravital kullanıcılar için geniş çapta uygulanabilir. Bildirilen analiz yaklaşımları paketi, kullanıcıların hizalanmış veya rastgele kollajen lifi konfigürasyonlarının bölgeleri arasındaki hücresel davranışı ayırt etmelerine, tümör mikro ortamının belirli bölgelerinde bulunan hücrelerin sayılarını veya davranışlarını karşılaştırmalarına ve vaskülatürü yalnızca etiketsiz veya içsel sinyal kullanarak tümör mikro ortamına eşlemelerine olanak sağlayacaktır. Birlikte, bu yöntemler meme bezinin 4D intravital görüntülemesinden elde edilen bilgi derinliğini en üst düzeye çıkarmak için operasyonel bir çerçeve oluştururken, ek eksojen etiketlere olan ihtiyacı en aza indirir.
4D intravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin mekansal ve zamansal bağlamındaki dinamik fizyolojik etkileşimleri araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu makale, tümör kütlesi, bitişik stroma veya vasküler ağa yakın dinamik hücre etkileşimlerini sadece ikinci harmonik jenerasyondan veya NAD (P) H otofloresansından gelen endojen sinyalleri kullanarak bölümlere ayırmak için çok temel ve uyarlanabilir bir operasyonel çerçeve sunmaktadır. Bu protokol, görüntüleme penceresinin impl…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bu çalışmayı finanse etmek için NCI R01 CA216248, CA206458 ve CA179556 hibelerini kabul etmek istiyor. Ayrıca, Dr. Kevin Eliceiri ve görüntüleme grubuna, intravital programımızın erken gelişimindeki teknik uzmanlıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Ben Cox’a ve Morgridge Araştırma Enstitüsü’ndeki Eliceiri İmalat Grubu’nun diğer üyelerine, MIW’nin ilk aşamalarındaki temel teknik tasarımları için teşekkür ederiz. Dr. Ellen Dobson, ImageJ eğitilebilir WEKA segmentasyon aracı hakkında yararlı konuşmalara yardımcı oldu. Ayrıca, mikroskoplarını zamanında kullandıkları için Dr. Melissa Skala ve Dr. Alexa Barres-Heaton’a teşekkür ederiz. Son olarak, fare kullanımı ve bakımıyla ilgili tüm düşünceli tartışmalar ve tavsiyeler için Dr. Brigitte Raabe, DVM’ye teşekkür ederiz.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |