Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l’analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.
La capacità di visualizzare interazioni fisiologiche complesse e dinamiche tra numerosi tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) all’interno di un microambiente tumorale vivo è un passo importante verso la comprensione dei meccanismi che regolano la progressione del tumore. Mentre questo può essere realizzato attraverso le attuali tecniche di imaging intravitale, rimane impegnativo a causa della natura eterogenea dei tessuti e della necessità di un contesto spaziale all’interno dell’osservazione sperimentale. A tal fine, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di imaging intravitale che accoppia l’imaging di seconda generazione armonica del collagene, la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H e la microscopia di imaging a vita di fluorescenza (FLIM) come mezzo per compartimentare in modo non invasivo il microambiente tumorale in domini di base del nido tumorale, dello stroma circostante o ECM e della vascolarizzazione. Questo protocollo non invasivo descrive in dettaglio il processo passo-passo che va dall’acquisizione di immagini time-lapse di modelli di tumore mammario all’analisi post-elaborazione e alla segmentazione delle immagini. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che sfrutta le firme metaboliche per contestualizzare il microambiente tumorale vivo che cambia dinamicamente senza l’uso di etichette fluorescenti esogene, rendendolo vantaggioso per i modelli di xenotrapianti derivati dal paziente umano (PDX) e per il futuro uso clinico in cui i fluorofori estrinseci non sono facilmente applicabili.
La matrice extracellulare (ECM) nel microambiente tumorale è nota per essere depositata dinamicamente e rimodellata da più tipi di cellule per facilitare ulteriormente la progressione della malattia 1,2,3. Queste alterazioni della matrice forniscono segnali sia meccanici che biologici che alterano il comportamento cellulare e spesso si traducono in un ciclo continuo di rimodellamento della matrice4. L’indagine sull’interazione dinamica e reciproca tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare viene spesso condotta utilizzando colture tridimensionali (3D) in vitro o sistemi microfluidici. Mentre questi approcci bottom-up hanno dimostrato meccanismi di rimodellamento dell’ECM 5,6,7, aumento della proliferazione8, transizione da epiteliale a mesenchimale 9,10,11,12 e migrazione e invasione delle cellule tumorali 7,13,14,15,16 , il loro focus si è concentrato principalmente su alcuni tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali o fibroblasti) all’interno di una matrice 3D omogenea rispetto alla diversità e all’eterogeneità delle interazioni presenti all’interno di un tessuto fisiologico. Oltre ai sistemi in vitro, l’istologia tumorale ex vivo può anche fornire alcune informazioni su queste interazioni cellula-cellula e cellula-ECM17. L’immunoistochimica ha il vantaggio di poter analizzare più tipi di cellule rispetto alla composizione e all’architettura spazialmente eterogenee dell’ECM, ma gli endpoint statici del tessuto fisso non catturano la natura dinamica delle interazioni tra le cellule e il microambiente. L’imaging intravitale ha aperto la porta per interrogare interazioni diverse e dinamiche all’interno del contesto fisiologico del microambiente tumorale nativo.
Le capacità dell’imaging tumorale intravitale stanno rapidamente avanzando. I miglioramenti nella progettazione delle finestre di imaging e le tecniche chirurgiche per impiantare le finestre hanno consentito l’imaging longitudinale del tumore a lungo termine in una varietà di posizioni anatomiche (ad esempio, tumore primario, linfonodi, siti metastatici 18,19,20). Inoltre, la capacità della strumentazione ottica di visualizzare e raccogliere dati in più dimensioni (ad esempio, spettrale, intensità di fluorescenza spaziale e durata) e ad alta risoluzione e velocità (velocità video) sta diventando ampiamente accessibile. La tecnologia migliorata offre l’opportunità di esplorare rapidi cambiamenti nella segnalazione cellulare e nelle dinamiche fenotipiche all’interno di un ambiente fisiologico. Infine, l’espansione degli strumenti optogenetici e l’ampia gamma di costrutti fluorescenti genetici consentono l’etichettatura di specifici tipi di cellule per catturare la migrazione cellulare nel microambiente tumorale o il tracciamento del lignaggio cellulare durante lo sviluppo o la progressione della malattia21,22. L’uso di questi strumenti in combinazione con la tecnologia CRISPR / Cas9 offre ai ricercatori l’opportunità di generare modelli animali unici in modo tempestivo.
Mentre tutti questi progressi rendono l’imaging intravitale un metodo sempre più potente per esplorare le interazioni cellulari dinamiche e fisiologiche, c’è ancora un’importante necessità di sviluppare strategie che forniscano un contesto spaziale, temporale e strutturale a livello tissutale a queste interazioni biologiche. Attualmente, molti studi di imaging intravitale compensano la mancanza di punti di riferimento visivi come i vasi sanguigni iniettando coloranti fluorescenti nella vascolarizzazione o impiegando modelli murini che esprimono esogenamente proteine fluorescenti per delineare le caratteristiche fisiche. Coloranti iniettabili e substrati come dextrans fluorescenti sono ampiamente utilizzati per etichettare con successo la vascolarizzazione nelle collezioni intravitali19, 23, 24. Tuttavia, questo approccio non è privo di limitazioni. Per uno, richiede ulteriori manipolazioni del mouse e la sua utilità è limitata agli esperimenti a breve termine. Per gli studi longitudinali, il destrano fluorescente può essere problematico in quanto osserviamo l’accumulo di destrano nelle cellule fagocitiche o la diffusione nel tessuto circostante nel tempo25. L’incorporazione di proteine fluorescenti esogene nel modello murino è stata presentata come alternativa al dextrans fluorescente, ma presenta dei limiti propri. La disponibilità e la diversità dei fluorofori esogeni all’interno dei modelli murini sono ancora limitate e costose da creare. Inoltre, in modelli specifici, come i modelli PDX, le manipolazioni genetiche non sono desiderabili o possibili. È stato anche dimostrato che la presenza di proteine fluorescenti o bioluminescenti all’interno delle cellule sono riconosciute come estranee all’interno del topo, e all’interno di modelli murini immunocompetenti, questo riduce la quantità di metastasi dovute alla risposta del sistema immunitario dell’ospite26,27. Infine, le proteine fluorescenti esogene o i coloranti fluorescenti utilizzati per il contesto spaziale o per segmentare i dati successivi spesso occupano intervalli primi dello spettro luminoso che potrebbero altrimenti essere utilizzati per indagare le interazioni fisiologiche di interesse.
L’uso del segnale intrinseco dall’ECM o della fluorescenza endogena dalle cellule all’interno del tessuto rappresenta un potenziale mezzo universale privo di etichette per segmentare i dati intravitali per un’analisi cellulare e spaziale più approfondita. La seconda generazione armonica (SHG) è stata a lungo utilizzata per visualizzare l’ECM28. Con il successivo sviluppo di importanti strumenti per aiutare nella caratterizzazione dell’organizzazione delle fibre 29,30,31, è possibile caratterizzare il comportamento cellulare relativo alla struttura ECM locale. Inoltre, l’autofluorescenza del metabolita endogeno, NAD(P)H, fornisce un altro strumento privo di etichette per compartimentare il microambiente tumorale in vivo. Nad(P)H fluoresce brillantemente nelle cellule tumorali e può essere utilizzato per discriminare i confini del nido tumorale in crescita dal suo stroma circostante21,32. Infine, la vascolarizzazione è un’importante struttura fisiologica nel microambiente tumorale e il sito di interazioni chiave specifiche per tipo cellulare 33,34,35. L’eccitazione dei globuli rossi (RBC) o del plasma sanguigno è stata utilizzata per visualizzare la vascolarizzazione tumorale e utilizzando l’eccitazione a due o tre fotoni (2P; 3P) la misurazione delle velocità del flusso sanguigno ha dimostrato di essere possibile36. Tuttavia, mentre i vasi sanguigni più grandi sono facilmente identificabili dalle loro firme di fluorescenza endogena, l’identificazione di piccoli vasi sanguigni sottili, variabili e meno fluorescenti richiede più esperienza. Queste difficoltà intrinseche ostacolano la segmentazione ottimale dell’immagine. Fortunatamente, queste fonti di fluorescenza endogena (cioè globuli rossi e plasma sanguigno) possono anche essere misurate mediante imaging a fluorescenzaa vita 37, che capitalizza sulle proprietà fotofisiche uniche della vascolarizzazione e rappresenta un’utile aggiunta alla crescente cassetta degli attrezzi intravitale.
In questo protocollo, viene descritto un flusso di lavoro per la segmentazione dell’imaging intravitale quadridimensionale (4D) utilizzando esplicitamente segnali intrinseci come la fluorescenza endogena e l’SHG dall’acquisizione all’analisi. Questo protocollo è particolarmente pertinente per gli studi longitudinali attraverso una finestra di imaging mammario in cui la fluorescenza esogena potrebbe non essere pratica o possibile, come nel caso dei modelli PDX. I principi di segmentazione qui delineati, tuttavia, sono ampiamente applicabili agli utenti intravitali che studiano la biologia del tumore, lo sviluppo dei tessuti o anche la normale fisiologia dei tessuti. La suite di approcci di analisi riportata consentirà agli utenti di differenziare il comportamento cellulare tra regioni di configurazioni di fibre di collagene allineate o casuali, confrontare numeri o comportamenti di cellule residenti in regioni specifiche del microambiente tumorale e mappare la vascolarizzazione al microambiente tumorale utilizzando solo il segnale privo di etichette o intrinseco. Insieme, questi metodi creano un quadro operativo per massimizzare la profondità delle informazioni acquisite dall’imaging intravitale 4D della ghiandola mammaria, riducendo al minimo la necessità di ulteriori etichette esogene.
L’imaging intravitale 4D è un potente strumento per studiare le interazioni fisiologiche dinamiche all’interno del contesto spaziale e temporale del microambiente tumorale nativo. Questo manoscritto fornisce un quadro operativo molto semplice e adattabile per compartimentare le interazioni cellulari dinamiche all’interno della massa tumorale, dello stroma adiacente o in prossimità della rete vascolare utilizzando solo segnali endogeni dalla seconda generazione armonica o dall’autofluorescenza NAD(P)H. Questo protocollo…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano riconoscere le sovvenzioni NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 per il finanziamento di questo lavoro. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Kevin Eliceiri e il suo gruppo di imaging per la loro esperienza tecnica nello sviluppo precoce del nostro programma intravitale. Ringraziamo anche il Dr. Ben Cox e altri membri dell’Eliceiri Fabrication Group presso il Morgridge Institute for Research per la loro progettazione tecnica essenziale durante le prime fasi del MIW. La dott.ssa Ellen Dobson ha assistito con conversazioni utili sullo strumento di segmentazione WEKA addestrabile ImageJ. Inoltre, vorremmo ringraziare la dott.ssa Melissa Skala e la dott.ssa Alexa Barres-Heaton per l’uso tempestivo del loro microscopio. Infine, vorremmo ringraziare la dott.ssa Brigitte Raabe, D.V.M, per tutte le discussioni premurose e i consigli sulla gestione e la cura del nostro mouse.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |