تستخدم طريقة التصوير داخل الحيوية الموصوفة هنا الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين والتألق الداخلي من العامل الأيضي المساعد NAD (P) H إلى تقسيم بيئة مجهرية للورم غير المسمى بشكل غير جراحي إلى مقصورات الورم واللحمية والأوعية الدموية لإجراء تحليل متعمق للصور الحيوية 4D.
تعد القدرة على تصور التفاعلات الفسيولوجية المعقدة والديناميكية بين العديد من أنواع الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل بيئة دقيقة حية للورم خطوة مهمة نحو فهم الآليات التي تنظم تطور الورم. في حين يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات التصوير داخل الحيوية الحالية ، إلا أنه لا يزال يمثل تحديا بسبب الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة والحاجة إلى السياق المكاني داخل الملاحظة التجريبية. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير سير عمل التصوير داخل الحيوية الذي يجمع بين تصوير الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين ، والتألق الداخلي من العامل المساعد الأيضي NAD (P) H ، والمجهر التصويري الفلوري مدى الحياة (FLIM) كوسيلة لتقسيم البيئة المجهرية للورم بشكل غير جراحي إلى المجالات الأساسية لعش الورم ، والسدى المحيط أو ECM ، والأوعية الدموية. يفصل هذا البروتوكول غير الجراحي العملية خطوة بخطوة التي تتراوح من الحصول على صور الفاصل الزمني لنماذج أورام الثدي إلى تحليل ما بعد المعالجة وتجزئة الصور. الميزة الأساسية لسير العمل هذا هي أنه يستغل التوقيعات الأيضية لوضع البيئة الدقيقة للورم الحي المتغيرة ديناميكيا في سياقها دون استخدام ملصقات الفلورسنت الخارجية ، مما يجعلها مفيدة لنماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض البشري والاستخدام السريري المستقبلي حيث لا يمكن تطبيق الفلوروفورات الخارجية بسهولة.
من المعروف أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) في البيئة الدقيقة للورم يتم ترسيبها ديناميكيا وإعادة تشكيلها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا لزيادة تسهيل تطور المرض1،2،3. توفر تعديلات المصفوفة هذه إشارات ميكانيكية وبيولوجية تغير سلوك الخلية وغالبا ما تؤدي إلى دورة مستمرة من إعادة تشكيل المصفوفة4. غالبا ما يتم إجراء التحقيق في التفاعل الديناميكي المتبادل بين الخلايا السرطانية والمصفوفة خارج الخلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية أو أنظمة الموائع الدقيقة. في حين أظهرت هذه النهج من القاعدة إلى القمة آليات إعادة تشكيل ECM 5,6,7 ، وزيادة الانتشار 8 ، والانتقال الظهاري إلى الوسيط 9,10,11,12 ، وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها 7,13,14,15,16 ، كان تركيزهم في المقام الأول على عدد قليل من أنواع الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا السرطانية أو الخلايا الليفية) ضمن مصفوفة 3D متجانسة مقارنة بتنوع وعدم تجانس التفاعلات الموجودة داخل الأنسجة الفسيولوجية. بالإضافة إلى الأنظمة المخبرية ، يمكن أن يوفر علم أنسجة الأورام خارج الجسم الحي أيضا بعض الأفكار حول تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM17. تتميز الكيمياء النسيجية المناعية بقدرتها على تحليل أنواع متعددة من الخلايا فيما يتعلق بالتكوين والبنية غير المتجانسين مكانيا ل ECM ، لكن نقاط النهاية الثابتة للأنسجة الثابتة لا تلتقط الطبيعة الديناميكية للتفاعلات بين الخلايا والبيئة الدقيقة. فتح التصوير داخل الحيوية الباب لاستجواب التفاعلات المتنوعة والديناميكية داخل السياق الفسيولوجي للبيئة الدقيقة للورم الأصلي.
قدرات التصوير داخل الورم الحيوي تتقدم بسرعة. وقد مكنت التحسينات في تصميم نوافذ التصوير والتقنيات الجراحية لزرع النوافذ من تصوير الورم الطولي على المدى الطويل في مجموعة متنوعة من المواقع التشريحية (أي الورم الأولي والغدد الليمفاوية والمواقع النقيلية18،19،20). وعلاوة على ذلك، أصبحت قدرة الأجهزة البصرية على تصور البيانات وجمعها في أبعاد متعددة (أي كثافة التألق الطيفي المكاني ومدى الحياة)، وبدقة وسرعة عاليتين (معدل الفيديو) متاحة على نطاق واسع. توفر التكنولوجيا المحسنة فرصة لاستكشاف التغيرات السريعة في إشارات الخلايا وديناميكيات النمط الظاهري داخل بيئة فسيولوجية. وأخيرا ، فإن التوسع في الأدوات البصرية الجينية ومجموعة واسعة من تركيبات الفلورسنت الجينية تسمح بوضع علامات على أنواع معينة من الخلايا لالتقاط هجرة الخلايا في البيئة الدقيقة للورم أو تتبع سلالة الخلية أثناء التطور أو تطور المرض21,22. يوفر استخدام هذه الأدوات مع تقنية CRISPR / Cas9 للباحثين الفرصة لإنشاء نماذج حيوانية فريدة في الوقت المناسب.
في حين أن كل هذه التطورات تجعل التصوير داخل الحيوية طريقة قوية بشكل متزايد لاستكشاف التفاعلات الخلوية الديناميكية والفسيولوجية ، لا تزال هناك حاجة مهمة لتطوير استراتيجيات توفر سياقا مكانيا وزمنيا وهيكليا على مستوى الأنسجة لهذه التفاعلات البيولوجية. في الوقت الحالي ، تعوض العديد من دراسات التصوير داخل الحيوية عن نقص المعالم البصرية مثل الأوعية الدموية عن طريق حقن الأصباغ الفلورية في الأوعية الدموية أو استخدام نماذج الفئران التي تعبر خارجيا عن بروتينات الفلورسنت لتحديد السمات الفيزيائية. تستخدم الأصباغ والركائز القابلة للحقن مثل ديكستران الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأوعية الدموية بنجاح في المجموعات الحيوية19 و 23 و 24. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يخلو من القيود. على سبيل المثال ، يتطلب الأمر تلاعبات إضافية بالماوس وتقتصر فائدته على التجارب قصيرة الأجل. بالنسبة للدراسات الطولية ، يمكن أن يكون ديكستران الفلورسنت مشكلة حيث نلاحظ تراكم الدكستران في الخلايا البلعمية أو الانتشار في الأنسجة المحيطة بمرور الوقت25. تم تقديم دمج البروتين الفلوري الخارجي في نموذج الفأر كبديل للديكستران الفلوري ولكنه يمثل قيودا خاصة به. لا يزال توافر وتنوع الفلوروفورات الخارجية داخل نماذج الفئران محدودا ومكلفا لإنشائه. بالإضافة إلى ذلك ، في نماذج محددة ، مثل نماذج PDX ، فإن التلاعب الجيني غير مرغوب فيه أو ممكن. وقد تبين أيضا أن وجود البروتينات الفلورية أو المضيئة الحيوية داخل الخلايا يتم التعرف عليها على أنها غريبة داخل الفأر ، وضمن نماذج الفئران المناعية ، وهذا يقلل من كمية الانبثاث بسبب استجابة الجهاز المناعي المضيف26,27. وأخيرا، غالبا ما تحتل البروتينات الفلورية الخارجية أو الأصباغ الفلورية المستخدمة في السياق المكاني أو لتقسيم البيانات اللاحقة نطاقات أولية من الطيف الضوئي يمكن استخدامها بطريقة أخرى للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية ذات الاهتمام.
يمثل استخدام الإشارة الجوهرية من ECM أو التألق الداخلي من الخلايا داخل الأنسجة وسيلة عالمية محتملة خالية من الملصقات لتقسيم البيانات داخل الحيوية لإجراء تحليل خلوي ومكاني أكثر تعمقا. لطالما استخدم الجيل التوافقي الثاني (SHG) لتصور ECM28. مع التطوير اللاحق لأدوات مهمة للمساعدة في توصيف تنظيم الألياف29،30،31 ، من الممكن توصيف سلوك الخلية بالنسبة لبنية ECM المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التألق الذاتي من المستقلب الداخلي ، NAD (P) H ، أداة أخرى خالية من الملصقات لتقسيم البيئة الدقيقة للورم في الجسم الحي. يتألق NAD(P)H بشكل مشرق في الخلايا السرطانية ويمكن استخدامه للتمييز بين حدود عش الورم المتنامي من السدى المحيط به21,32. وأخيرا ، فإن الأوعية الدموية هي بنية فسيولوجية مهمة في البيئة الدقيقة للورم وموقع التفاعلات الرئيسية الخاصة بنوع الخلية 33،34،35. تم استخدام إثارة خلايا الدم الحمراء (RBC) أو بلازما الدم لتصور الأوعية الدموية للورم ، وباستخدام إثارة اثنين أو ثلاثة فوتونات (2P ؛ 3P) ، تبين أن قياس معدلات تدفق الدم ممكن36. ومع ذلك ، في حين أن الأوعية الدموية الأكبر يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال توقيعات التألق الداخلية الخاصة بها ، فإن تحديد الأوعية الدموية الصغيرة الدقيقة والمتغيرة والأقل فلورسنت يتطلب المزيد من الخبرة. هذه الصعوبات المتأصلة تعيق تجزئة الصورة المثلى. لحسن الحظ ، يمكن أيضا قياس مصادر التألق الداخلي (أي خلايا الدم الحمراء وبلازما الدم) عن طريق التصوير الفلوري مدى الحياة37 ، والذي يستفيد من الخصائص الفيزيائية الضوئية الفريدة للأوعية الدموية ويمثل إضافة مفيدة إلى صندوق الأدوات المتنامي داخل الحيوية.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير عمل لتجزئة التصوير داخل الحيوية رباعي الأبعاد (4D) بشكل صريح باستخدام إشارات جوهرية مثل التألق الداخلي و SHG من الاستحواذ إلى التحليل. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدراسات الطولية من خلال نافذة تصوير الثدييات حيث قد لا يكون التألق الخارجي عمليا أو ممكنا ، كما هو الحال مع نماذج PDX. ومع ذلك ، فإن مبادئ التجزئة الموضحة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على المستخدمين داخل المناطق الحيوية الذين يحققون في بيولوجيا الورم أو تطور الأنسجة أو حتى فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية. ستسمح مجموعة أساليب التحليل المبلغ عنها للمستخدمين بالتمييز بين السلوك الخلوي بين مناطق تكوينات ألياف الكولاجين المحاذاة أو العشوائية ، ومقارنة أعداد أو سلوكيات الخلايا الموجودة في مناطق محددة من البيئة الدقيقة للورم ، وتعيين الأوعية الدموية إلى البيئة الدقيقة للورم باستخدام إشارة خالية من الملصقات أو جوهرية فقط. معا ، تخلق هذه الأساليب إطارا تشغيليا لزيادة عمق المعلومات المكتسبة من التصوير الحيوي 4D للغدة الثديية مع تقليل الحاجة إلى ملصقات خارجية إضافية.
التصوير داخل الحيوية 4D هو أداة قوية للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية الديناميكية داخل السياق المكاني والزمني للبيئة الدقيقة للورم الأصلي. توفر هذه المخطوطة إطارا تشغيليا أساسيا وقابلا للتكيف لتقسيم تفاعلات الخلايا الديناميكية داخل كتلة الورم أو السدى المجاورة أو على مقربة من شبكة الأو…
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن ينوه بمنح NCI R01 CA216248 و CA206458 و CA179556 لتمويل هذا العمل. نود أيضا أن نشيد بالدكتور كيفن إليسيري ومجموعة التصوير الخاصة به على خبرتهم التقنية في التطوير المبكر لبرنامجنا الحيوي. كما نشكر الدكتور بن كوكس والأعضاء الآخرين في مجموعة Eliceiri Fabrication Group في معهد Morgridge للأبحاث على تصميمهم التقني الأساسي خلال المراحل المبكرة من MIW. ساعدت الدكتورة إلين دوبسون في إجراء محادثات مفيدة حول أداة تجزئة WEKA القابلة للتدريب على ImageJ. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكتورة ميليسا سكالا والدكتورة أليكسا باريس هيتون على استخدام المجهر في الوقت المناسب. وأخيرا، نود أن نشكر الدكتورة بريجيت رابي، D.V.M، على جميع المناقشات المدروسة والنصائح حول التعامل مع الماوس والعناية به.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |