O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.
A capacidade de visualizar interações fisiológicas complexas e dinâmicas entre numerosos tipos de células e a matriz extracelular (ECM) dentro de um microambiente tumoral vivo é um passo importante para entender mecanismos que regulam a progressão do tumor. Embora isso possa ser realizado através das técnicas atuais de imagem intravital, ela permanece desafiadora devido à natureza heterogênea dos tecidos e à necessidade de contexto espacial dentro da observação experimental. Para isso, desenvolvemos um fluxo de trabalho de imagem intravital que emparelha a imagem de segunda geração harmônica de colágeno, fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H, e microscopia de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) como meio de compartimentar não invasivamente o microambiente tumoral do tumor em domínios básicos do ninho tumoral, o estroma circundante ou ECM, e a vaculatura. Este protocolo não invasivo detalha o processo passo a passo que vai desde a aquisição de imagens de lapso de tempo de modelos de tumores mamários até análise pós-processamento e segmentação de imagens. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele explora assinaturas metabólicas para contextualizar o microambiente tumoral vivo em mudança dinâmica sem o uso de rótulos fluorescentes exógenos, tornando-o vantajoso para modelos de xenerto derivados do paciente humano (PDX) e uso clínico futuro onde fluoroforos extrínsecos não são prontamente aplicáveis.
A matriz extracelular (ECM) no microambiente tumoral é conhecida por ser dinamicamente depositada e remodelada por múltiplos tipos de células para facilitar ainda mais a progressão da doença 1,2,3. Essas alterações matriciais fornecem sinais mecânicos e biológicos que alteram o comportamento celular e muitas vezes resultam em um ciclo contínuo de remodelação matricial4. A investigação sobre a interação dinâmica e recíproca entre as células tumorais e a matriz extracelular é frequentemente conduzida usando cultura tridimensional (3D) in vitro ou sistemas microfluidos. Embora essas abordagens de baixo para cima tenham demonstrado mecanismos de remodelação do ECM 5,6,7, aumento da proliferação8, epitelial para transição mesenquimal 9,10,11,12, e migração e invasão de células tumorais 7,13,14,15,16 , seu foco tem sido principalmente em alguns tipos de células (por exemplo, células tumorais ou fibroblastos) dentro de uma matriz 3D homogênea em comparação com a diversidade e heterogeneidade das interações presentes dentro de um tecido fisiológico. Além dos sistemas in vitro, a histologia tumoral ex vivo também pode fornecer algumas informações sobre essas interações célula-célula e célula-ECM17. A imunohistoquímica tem a vantagem de poder analisar múltiplos tipos celulares no que diz respeito à composição espacialmente heterogênea e arquitetura do ECM, mas os pontos finais estáticos do tecido fixo não captam a natureza dinâmica das interações entre as células e o microambiente. A imagem intravital abriu a porta para interrogar interações diversas e dinâmicas dentro do contexto fisiológico do microambiente tumoral nativo.
As capacidades de imagem de tumor intravital estão avançando rapidamente. Melhorias no design de janelas de imagem e técnicas cirúrgicas para implantar as janelas permitiram imagens longitudinais de tumor a longo prazo em uma variedade de locais anatômicos (ou seja, tumor primário, linfonodos, sítios metastáticos 18,19,20). Além disso, a capacidade de instrumentação óptica para visualizar e coletar dados em múltiplas dimensões (ou seja, intensidade espectral, fluorescência espacial e vida útil), e em alta resolução e velocidade (taxa de vídeo) está se tornando amplamente acessível. A tecnologia aprimorada oferece uma oportunidade para explorar mudanças rápidas na sinalização celular e dinâmica fenotípica dentro de um ambiente fisiológico. Por fim, a expansão das ferramentas optogenéticas e a ampla gama de construções fluorescentes genéticas permitem a marcação de tipos celulares específicos para capturar a migração celular no microambiente tumoral ou rastreamento de linhagem celular durante o desenvolvimento ou progressão da doença21,22. O uso dessas ferramentas em combinação com a tecnologia CRISPR/Cas9 proporciona aos pesquisadores a oportunidade de gerar modelos animais únicos em tempo hábil.
Embora todos esses avanços tornem a imagem intravital um método cada vez mais poderoso para explorar interações celulares dinâmicas e fisiológicas, ainda há uma necessidade importante de desenvolver estratégias que forneçam contexto espacial, temporal e estrutural no nível tecidual a essas interações biológicas. Atualmente, muitos estudos de imagem intravital compensam a falta de marcos visuais, como os vasos sanguíneos, injetando corantes fluorescentes na vasculatura ou empregando modelos de camundongos que exógenos expressam proteínas fluorescentes para delinear características físicas. Corantes injetáveis e substratos como dextrans fluorescentes são amplamente utilizados para rotular com sucesso a vasculatura nas coleções intravitais19, 23, 24. No entanto, essa abordagem não é sem limitações. Por um tempo, requer manipulações adicionais de mouse e sua utilidade está limitada a experimentos de curto prazo. Para estudos longitudinais, o dextran fluorescente pode ser problemático, pois observamos o acúmulo de dextran em células fagocíticas ou difusão no tecido circundante ao longo do tempo25. A incorporação de proteínas fluorescentes exógenas no modelo do camundongo tem sido apresentada como uma alternativa aos dextrans fluorescentes, mas apresenta limitações próprias. A disponibilidade e a diversidade de fluoroforos exógenos dentro dos modelos de mouse ainda são limitadas e caras de criar. Além disso, em modelos específicos, como modelos PDX, manipulações genéticas não são desejáveis ou possíveis. Também foi demonstrado que a presença de proteínas fluorescentes ou bioluminescentes dentro das células são reconhecidas como estrangeiras dentro do camundongo, e dentro de modelos de camundongos imunocompetuntes, isso reduz a quantidade de metástase devido à resposta do sistema imunológico hospedeiro26,27. Por fim, proteínas fluorescentes exógenas ou corantes fluorescentes usados para contexto espacial ou para segmentar dados subsequentes muitas vezes ocupam faixas primos do espectro de luz que poderiam ser usadas para investigar as interações fisiológicas de interesse.
O uso do sinal intrínseco do ECM ou fluorescência endógena das células dentro do tecido representa um potencial meio universal livre de rótulos para segmentar dados intravitais para uma análise celular e espacial mais aprofundada. A segunda geração harmônica (SHG) tem sido usada há muito tempo para visualizar o ECM28. Com o desenvolvimento subsequente de importantes ferramentas para auxiliar na caracterização da organização defibras 29,30,31, é possível caracterizar o comportamento celular em relação à estrutura local de ECM. Além disso, a autofluorescência do metabólito endógeno, NAD(P)H, fornece outra ferramenta sem rótulos para compartimentar o microambiente tumoral in vivo. Nad(P)H fluoresce brilhantemente em células tumorais e pode ser usado para discriminar os limites do ninho tumoral em crescimento de seu estroma circundante21,32. Por fim, a vasculatura é uma importante estrutura fisiológica no microambiente tumoral e local de interações específicas do tipo celular chave 33,34,35. A excitação dos glóbulos vermelhos (RBC) ou plasma sanguíneo tem sido usada para visualizar a vasculatura tumoral, e usando excitação de dois ou três fótons (2P; 3P) a medição das taxas de fluxo sanguíneo tem se mostrado possível36. No entanto, enquanto os vasos sanguíneos maiores são facilmente identificáveis por suas assinaturas de fluorescência endógena, a identificação de vasos sanguíneos pequenos sutis, variáveis e menos fluorescentes requer mais conhecimento. Essas dificuldades inerentes dificultam a segmentação de imagem ideal. Felizmente, essas fontes de fluorescência endógena (ou seja, glóbulos vermelhos e plasma de sangue) também podem ser medidas pela imagem de vida fluorescência37, que capitaliza as propriedades fotofísicas únicas da vasculatura e representa uma adição útil à crescente caixa de ferramentas intravital.
Neste protocolo, um fluxo de trabalho para a segmentação de imagens intravitais quadridimensionais (4D) explicitamente utilizando sinais intrínsecos como fluorescência endógena e SHG é descrito desde a aquisição até a análise. Este protocolo é particularmente pertinente para estudos longitudinais através de uma janela de imagem mamária onde a fluorescência exógena pode não ser prática ou possível, como é o caso dos modelos PDX. Os princípios de segmentação aqui descritos, no entanto, são amplamente aplicáveis aos usuários intravitais que investigam biologia tumoral, desenvolvimento de tecidos ou mesmo fisiologia tecidual normal. O conjunto de abordagens de análise relatadas permitirá aos usuários diferenciar o comportamento celular entre regiões de configurações alinhadas ou aleatórias de fibra de colágeno, comparar números ou comportamentos de células residentes em regiões específicas do microambiente tumoral e mapear a vasculatura para o microambiente tumoral usando apenas sinal livre de rótulos ou intrínsecos. Juntos, esses métodos criam uma estrutura operacional para maximizar a profundidade das informações obtidas a partir da imagem intravital 4D da glândula mamária, minimizando a necessidade de rótulos exógenos adicionais.
A imagem intravital 4D é uma ferramenta poderosa para investigar interações fisiológicas dinâmicas dentro do contexto espacial e temporal do microambiente tumoral nativo. Este manuscrito fornece uma estrutura operacional muito básica e adaptável para compartimentar interações celulares dinâmicas dentro da massa tumoral, do estroma adjacente ou nas proximidades da rede vascular usando apenas sinais endógenos de segunda geração harmônica ou autofluorescência NAD(P)H). Este protocolo fornece um método abrang…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer as subvenções NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 para financiar este trabalho. Também gostaríamos de reconhecer o Dr. Kevin Eliceiri e seu grupo de imagens por sua experiência técnica no desenvolvimento precoce do nosso programa intravital. Agradecemos também ao Dr. Ben Cox e outros membros do Grupo de Fabricação Eliceiri do Instituto morgridge de pesquisa por seu design técnico essencial durante as fases iniciais do MIW. Ellen Dobson ajudou com conversas úteis sobre a ferramenta de segmentação WEKA capacitável ImageJ. Além disso, gostaríamos de agradecer à Dra. Por último, gostaríamos de agradecer à Dra.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |