Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.
Die Fähigkeit, komplexe und dynamische physiologische Interaktionen zwischen zahlreichen Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb einer lebenden Tumormikroumgebung zu visualisieren, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis von Mechanismen, die das Fortschreiten von Tumoren regulieren. Während dies durch aktuelle intravitale Bildgebungsverfahren erreicht werden kann, bleibt es aufgrund der heterogenen Natur der Gewebe und der Notwendigkeit eines räumlichen Kontexts innerhalb der experimentellen Beobachtung eine Herausforderung. Zu diesem Zweck haben wir einen intravitalen Bildgebungs-Workflow entwickelt, der Kollagen-Bildgebung der zweiten harmonischen Generation, endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD (P) H und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) kombiniert, um die Tumormikroumgebung nicht-invasiv in grundlegende Domänen des Tumornestes, des umgebenden Stromas oder ECM und des Gefäßsystems zu unterteilen. Dieses nicht-invasive Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess, der von der Aufnahme von Zeitrafferbildern von Brusttumormodellen bis hin zur Nachbearbeitungsanalyse und Bildsegmentierung reicht. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, dass er metabolische Signaturen nutzt, um die sich dynamisch verändernde Mikroumgebung von lebenden Tumoren ohne die Verwendung exogener fluoreszierender Markierungen zu kontextualisieren, was ihn für PDX-Modelle (Human Patient-derived Xenograft) und den zukünftigen klinischen Einsatz, bei dem extrinsische Fluorophore nicht ohne weiteres anwendbar sind, vorteilhaft macht.
Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Tumormikroumgebung von mehreren Zelltypen dynamisch abgelagert und ummodelliert wird, um das Fortschreiten der Krankheit weiter zu erleichtern 1,2,3. Diese Matrixveränderungen liefern sowohl mechanische als auch biologische Hinweise, die das Zellverhalten verändern und oft zu einem kontinuierlichen Zyklus der Matrixumgestaltungführen 4. Die Untersuchung des dynamischen, wechselseitigen Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der extrazellulären Matrix erfolgt häufig mittels dreidimensionaler (3D) In-vitro-Kultur oder mikrofluidischer Systeme. Während diese Bottom-up-Ansätze Mechanismen der ECM-Remodellierung 5,6,7, der erhöhten Proliferation 8, des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs 9,10,11,12 und der Tumorzellmigration und -invasion7,13,14,15,16 gezeigt haben lag ihr Fokus in erster Linie auf einigen wenigen Zelltypen (z. B. Tumorzellen oder Fibroblasten) innerhalb einer homogenen 3D-Matrix im Vergleich zur Vielfalt und Heterogenität der Interaktionen innerhalb eines physiologischen Gewebes. Neben In-vitro-Systemen kann auch die Ex-vivo-Tumorhistologie einen Einblick in diese Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionengeben 17. Die Immunhistochemie hat den Vorteil, dass sie mehrere Zelltypen in Bezug auf die räumlich heterogene Zusammensetzung und Architektur der EZM analysieren kann, aber die statischen Endpunkte von fixiertem Gewebe erfassen nicht die dynamische Natur der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der Mikroumgebung. Die intravitale Bildgebung hat die Tür geöffnet, um vielfältige und dynamische Interaktionen im physiologischen Kontext der nativen Tumormikroumgebung zu hinterfragen.
Die Fähigkeiten der intravitalen Tumorbildgebung entwickeln sich rasant weiter. Verbesserungen im Design von Bildgebungsfenstern und chirurgischen Techniken zur Implantation der Fenster haben eine langfristige longitudinale Tumorbildgebung an einer Vielzahl von anatomischen Stellen (d.h. Primärtumor, Lymphknoten, metastasierende Stellen18,19,20) ermöglicht. Darüber hinaus wird die Fähigkeit optischer Instrumente, Daten in mehreren Dimensionen (d. h. spektrale, räumliche Fluoreszenzintensität und Lebensdauer) sowie mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit (Videorate) zu visualisieren und zu sammeln, immer zugänglicher. Die verbesserte Technologie bietet die Möglichkeit, schnelle Veränderungen der Zellsignalisierung und der phänotypischen Dynamik in einer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Schließlich ermöglichen die Erweiterung optogenetischer Werkzeuge und die breite Palette genetischer Fluoreszenzkonstrukte die Markierung spezifischer Zelltypen, um die Zellmigration in der Tumormikroumgebung oder die Zelllinienverfolgung während der Entwicklung oder des Krankheitsverlaufs zu erfassen21,22. Der Einsatz dieser Werkzeuge in Kombination mit der CRISPR/Cas9-Technologie bietet Forschern die Möglichkeit, zeitnah einzigartige Tiermodelle zu generieren.
Während all diese Fortschritte die intravitale Bildgebung zu einer immer leistungsfähigeren Methode zur Erforschung dynamischer und physiologischer zellulärer Interaktionen machen, besteht immer noch ein wichtiger Bedarf, Strategien zu entwickeln, die diesen biologischen Interaktionen einen räumlichen, zeitlichen und strukturellen Kontext auf Gewebeebene bieten. Derzeit kompensieren viele intravitale Bildgebungsstudien den Mangel an visuellen Landmarken wie Blutgefäßen, indem sie fluoreszierende Farbstoffe in das Gefäßsystem injizieren oder Mausmodelle verwenden, die exogen fluoreszierende Proteine exogen exprimieren, um physikalische Merkmale abzugrenzen. Injizierbare Farbstoffe und Substrate wie fluoreszierendes Dextrans werden breit eingesetzt, um das Gefäßsystem in intravitalen Sammlungen19, 23, 24 erfolgreich zu beschriften. Dieser Ansatz ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Zum einen erfordert es zusätzliche Mausmanipulationen und sein Nutzen beschränkt sich auf kurzfristige Experimente. Für Längsschnittstudien kann fluoreszierendes Dextran problematisch sein, da wir die Ansammlung von Dextran in phagozytären Zellen oder die Diffusion in das umgebende Gewebe im Laufe der Zeit beobachten25. Die exogene fluoreszierende Proteinintegration in das Mausmodell wurde als Alternative zu fluoreszierendem Dextrans vorgestellt, weist jedoch eigene Einschränkungen auf. Die Verfügbarkeit und Vielfalt exogener Fluorophore in Mausmodellen ist immer noch begrenzt und teuer in der Herstellung. Darüber hinaus sind genetische Manipulationen in bestimmten Modellen, wie z. B. PDX-Modellen, nicht wünschenswert oder möglich. Es wurde auch gezeigt, dass das Vorhandensein von fluoreszierenden oder biolumineszierenden Proteinen in Zellen innerhalb der Maus als fremd erkannt wird, und in immunkompetenten Mausmodellen reduziert dies die Menge an Metastasen aufgrund der Reaktion des Immunsystems des Wirts26,27. Schließlich belegen exogene fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Farbstoffe, die für den räumlichen Kontext oder zur Segmentierung nachfolgender Daten verwendet werden, häufig Primbereiche des Lichtspektrums, die sonst zur Untersuchung der physiologischen Wechselwirkungen von Interesse verwendet werden könnten.
Die Verwendung des intrinsischen Signals aus dem ECM oder der endogenen Fluoreszenz von Zellen innerhalb des Gewebes stellt ein potenzielles universelles markierungsfreies Mittel zur Segmentierung intravitaler Daten für eine eingehendere zelluläre und räumliche Analyse dar. Die zweite harmonische Generation (SHG) wird seit langem zur Visualisierung des ECM28 verwendet. Mit der anschließenden Entwicklung wichtiger Werkzeuge zur Charakterisierung der Faserorganisation 29,30,31 ist es möglich, das Zellverhalten relativ zur lokalen ECM-Struktur zu charakterisieren. Darüber hinaus bietet die Autofluoreszenz des endogenen Metaboliten NAD(P)H ein weiteres markierungsfreies Werkzeug, um die Tumormikroumgebung in vivo zu kompartimentieren. NAD(P)H fluoresziert hell in Tumorzellen und kann verwendet werden, um die Grenzen des wachsenden Tumornestes von seinem umgebenden Stroma21,32 zu unterscheiden. Schließlich ist das Gefäßsystem eine wichtige physiologische Struktur in der Tumormikroumgebung und der Ort der wichtigsten zelltypspezifischen Interaktionen33,34,35. Die Anregung von roten Blutkörperchen (RBC) oder Blutplasma wurde verwendet, um das Tumorgefäßsystem sichtbar zu machen, und unter Verwendung der Zwei- oder Drei-Photonen-Anregung (2P; 3P) hat sich die Messung der Blutflussraten als möglicherwiesen 36. Während größere Blutgefäße jedoch leicht durch ihre endogenen Fluoreszenzsignaturen identifizierbar sind, erfordert die Identifizierung subtiler, variabler und weniger fluoreszierender kleiner Blutgefäße mehr Fachwissen. Diese inhärenten Schwierigkeiten behindern eine optimale Bildsegmentierung. Glücklicherweise können diese Quellen der endogenen Fluoreszenz (d. H. Rote Blutkörperchen und Blutplasma) auch durch Fluoreszenzlebensdauerbildgebung37 gemessen werden, die die einzigartigen photophysikalischen Eigenschaften des Gefäßsystems nutzt und eine nützliche Ergänzung der wachsenden intravitalen Toolbox darstellt.
In diesem Protokoll wird ein Workflow zur Segmentierung der vierdimensionalen (4D) intravitalen Bildgebung beschrieben, der explizit intrinsische Signale wie endogene Fluoreszenz und SHG von der Erfassung bis zur Analyse verwendet. Dieses Protokoll ist besonders relevant für Längsschnittstudien durch ein Brustbildgebungsfenster, in dem exogene Fluoreszenz möglicherweise nicht praktikabel oder möglich ist, wie dies bei PDX-Modellen der Fall ist. Die hier beschriebenen Segmentierungsprinzipien sind jedoch weitgehend auf intravitale Anwender anwendbar, die Tumorbiologie, Gewebeentwicklung oder sogar normale Gewebephysiologie untersuchen. Die berichtete Suite von Analyseansätzen wird es den Benutzern ermöglichen, das zelluläre Verhalten zwischen Regionen ausgerichteter oder zufälliger Kollagenfaserkonfigurationen zu unterscheiden, die Anzahl oder das Verhalten von Zellen zu vergleichen, die sich in bestimmten Regionen der Tumormikroumgebung befinden, und das Gefäßsystem der Tumormikroumgebung zuzuordnen, wobei nur markierungsfreie oder intrinsische Signale verwendet werden. Zusammen schaffen diese Methoden einen operativen Rahmen für die Maximierung der Informationstiefe aus der intravitalen 4D-Bildgebung der Brustdrüse bei gleichzeitiger Minimierung des Bedarfs an zusätzlichen exogenen Markierungen.
Die intravitale 4D-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung dynamischer physiologischer Wechselwirkungen im räumlichen und zeitlichen Kontext der nativen Tumormikroumgebung. Dieses Manuskript bietet einen sehr grundlegenden und anpassungsfähigen Betriebsrahmen, um dynamische Zellinteraktionen innerhalb der Tumormasse, des benachbarten Stromas oder in der Nähe des Gefäßnetzwerks zu unterteilen, wobei nur endogene Signale aus der zweiten harmonischen Erzeugung oder der NAD(P)H-Autofluoreszenz ver…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten NCI R01 CA216248, CA206458 und CA179556 Zuschüsse für die Finanzierung dieser Arbeit anerkennen. Wir möchten auch Dr. Kevin Eliceiri und seiner Imaging-Gruppe für ihre technische Expertise bei der frühen Entwicklung unseres intravitalen Programms danken. Wir danken auch Dr. Ben Cox und anderen Mitgliedern der Eliceiri Fabrication Group am Morgridge Institute for Research für ihr wesentliches technisches Design während der frühen Phasen des MIW. Dr. Ellen Dobson half mit nützlichen Gesprächen über das trainierbare WEKA-Segmentierungstool ImageJ. Darüber hinaus möchten wir uns bei Dr. Melissa Skala und Dr. Alexa Barres-Heaton für den rechtzeitigen Einsatz ihres Mikroskops bedanken. Abschließend möchten wir uns bei Dr. Brigitte Raabe, D.V.M., für all die nachdenklichen Diskussionen und Ratschläge zu unserem Umgang mit und unserer Pflege der Maus bedanken.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |