Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren
Summary
De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.
Abstract
Het vermogen om complexe en dynamische fysiologische interacties tussen talrijke celtypen en de extracellulaire matrix (ECM) in een levende tumormicro-omgeving te visualiseren, is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van mechanismen die tumorprogressie reguleren. Hoewel dit kan worden bereikt door middel van de huidige intravitale beeldvormingstechnieken, blijft het een uitdaging vanwege de heterogene aard van weefsels en de behoefte aan ruimtelijke context binnen de experimentele observatie. Hiertoe hebben we een intravitale beeldvormingsworkflow ontwikkeld die collageen tweede harmonische generatie beeldvorming, endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) combineert als een middel om de tumormicro-omgeving niet-invasief te compartimenteren in basisdomeinen van het tumornest, het omringende stroma of ECM en de vasculatuur. Dit niet-invasieve protocol beschrijft het stapsgewijze proces, variërend van het verkrijgen van time-lapse-beelden van borsttumormodellen tot nabewerkingsanalyse en beeldsegmentatie. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat het metabole handtekeningen gebruikt om de dynamisch veranderende levende tumormicro-omgeving te contextualiseren zonder het gebruik van exogene fluorescerende labels, waardoor het voordelig is voor van de mens afgeleide xenograft (PDX) -modellen en toekomstig klinisch gebruik waar extrinsieke fluoroforen niet gemakkelijk toepasbaar zijn.
Introduction
Het is bekend dat de extracellulaire matrix (ECM) in de micro-omgeving van de tumor dynamisch wordt afgezet en geremodelleerd door meerdere celtypen om de progressie van de ziekte verder te vergemakkelijken 1,2,3. Deze matrixveranderingen bieden zowel mechanische als biologische signalen die het celgedrag veranderen en vaak resulteren in een voortdurende cyclus van matrixremodellering4. Onderzoek naar het dynamische, wederzijdse samenspel tussen tumorcellen en de extracellulaire matrix wordt vaak uitgevoerd met behulp van driedimensionale (3D) in vitro cultuur of microfluïdische systemen. Terwijl deze bottom-up benaderingen mechanismen van ECM-remodellering 5,6,7 hebben aangetoond, verhoogde proliferatie8, epitheliale naar mesenchymale overgang 9,10,11,12, en tumorcelmigratie en invasie 7,13,14,15,16 , hun focus lag voornamelijk op een paar celtypen (bijvoorbeeld tumorcellen of fibroblasten) binnen een homogene 3D-matrix in vergelijking met de diversiteit en heterogeniteit van interacties die aanwezig zijn in een fysiologisch weefsel. Naast in vitro systemen kan ook ex vivo tumorhistologie enig inzicht geven in deze cel-cel en cel-ECM interacties17. Immunohistochemie heeft het voordeel dat het meerdere celtypen kan analyseren met betrekking tot de ruimtelijk heterogene samenstelling en architectuur van de ECM, maar de statische eindpunten van vast weefsel vangen niet de dynamische aard van interacties tussen cellen en de micro-omgeving. Intravitale beeldvorming heeft de deur geopend om diverse en dynamische interacties te ondervragen binnen de fysiologische context van de inheemse tumormicro-omgeving.
De mogelijkheden van intravitale tumorbeeldvorming gaan snel vooruit. Verbeteringen in het ontwerp van beeldvormingsvensters en chirurgische technieken om de vensters te implanteren hebben longitudinale tumorbeeldvorming op lange termijn mogelijk gemaakt op verschillende anatomische locaties (d.w.z. primaire tumor, lymfeklieren, gemetastaseerde plaatsen 18,19,20). Bovendien wordt het vermogen van optische instrumentatie om gegevens in meerdere dimensies (d.w.z. spectraal, ruimtelijke fluorescentie-intensiteit en levensduur) en met hoge resolutie en snelheid (videosnelheid) te visualiseren en te verzamelen, algemeen toegankelijk. De verbeterde technologie biedt de mogelijkheid om snelle veranderingen in celsignalering en fenotypische dynamica binnen een fysiologische omgeving te onderzoeken. Ten slotte maken de uitbreiding van optogenetische hulpmiddelen en het brede scala aan genetische fluorescerende constructies het mogelijk om specifieke celtypen te taggen om celmigratie in de tumormicro-omgeving of cellijntracering tijdens ontwikkeling of ziekteprogressie vast te leggen21,22. Het gebruik van deze tools in combinatie met CRISPR/Cas9-technologie biedt onderzoekers de mogelijkheid om tijdig unieke diermodellen te genereren.
Hoewel al deze ontwikkelingen intravitale beeldvorming een steeds krachtigere methode maken om dynamische en fysiologische cellulaire interacties te verkennen, is er nog steeds een belangrijke behoefte om strategieën te ontwikkelen die ruimtelijke, temporele en structurele context op weefselniveau bieden aan deze biologische interacties. Momenteel compenseren veel intravitale beeldvormingsstudies het gebrek aan visuele oriëntatiepunten zoals bloedvaten door fluorescerende kleurstoffen in de vasculatuur te injecteren of muismodellen te gebruiken die exogene fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om fysieke kenmerken af te bakenen. Injecteerbare kleurstoffen en substraten zoals fluorescerende dextrans worden breed gebruikt om de vasculatuur met succes te labelen in intravitale collecties19, 23, 24. Deze aanpak is echter niet zonder beperkingen. Ten eerste vereist het extra muismanipulaties en is het nut ervan beperkt tot kortetermijnexperimenten. Voor longitudinale studies kan fluorescerend dextran problematisch zijn omdat we de accumulatie van dextran in fagocytische cellen of diffusie in het omliggende weefsel in de loop van de tijd waarnemen25. Exogene fluorescerende eiwitopname in het muismodel is gepresenteerd als een alternatief voor fluorescerende dextrans, maar vertoont zijn eigen beperkingen. De beschikbaarheid en diversiteit van exogene fluoroforen binnen muismodellen zijn nog steeds beperkt en duur om te maken. Bovendien zijn in specifieke modellen, zoals PDX-modellen, genetische manipulaties niet wenselijk of mogelijk. Het is ook aangetoond dat de aanwezigheid van fluorescerende of bioluminescente eiwitten in cellen worden herkend als vreemd in de muis, en binnen immunocompetente muismodellen vermindert dit de hoeveelheid metastase als gevolg van de reactie van het immuunsysteem van de gastheer26,27. Ten slotte bezetten exogene fluorescerende eiwitten of fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor ruimtelijke context of om latere gegevens te segmenteren vaak prime-bereiken van het lichtspectrum die anders zouden kunnen worden gebruikt om de fysiologische interacties van belang te onderzoeken.
Het gebruik van het intrinsieke signaal van de ECM of endogene fluorescentie van cellen in het weefsel vertegenwoordigt een potentieel universeel labelvrij middel om intravitale gegevens te segmenteren voor meer diepgaande cellulaire en ruimtelijke analyse. Second harmonic generation (SHG) wordt al lang gebruikt om de ECM28 te visualiseren. Met de daaropvolgende ontwikkeling van belangrijke hulpmiddelen om te helpen bij de karakterisering van vezelorganisatie 29,30,31, is het mogelijk om celgedrag te karakteriseren ten opzichte van de lokale ECM-structuur. Bovendien biedt autofluorescentie van de endogene metaboliet, NAD(P)H, een ander labelvrij hulpmiddel om de tumormicro-omgeving in vivo te compartimenteren. NAD(P)H fluoresceert helder in tumorcellen en kan worden gebruikt om de grenzen van het groeiende tumornest te onderscheiden van het omringende stroma21,32. Ten slotte is de vasculatuur een belangrijke fysiologische structuur in de tumormicro-omgeving en de plaats van belangrijke celtypespecifieke interacties 33,34,35. De excitatie van rode bloedcellen (RBC) of bloedplasma is gebruikt om de vasculatuur van de tumor te visualiseren, en met behulp van twee- of drie-foton excitatie (2P; 3P) is aangetoond dat het meten van bloedstroomsnelheden mogelijk is36. Hoewel grotere bloedvaten gemakkelijk te herkennen zijn aan hun endogene fluorescentiehandtekeningen, vereist de identificatie van subtiele, variabele en minder fluorescerende kleine bloedvaten meer expertise. Deze inherente moeilijkheden belemmeren een optimale beeldsegmentatie. Gelukkig kunnen deze bronnen van endogene fluorescentie (d.w.z. rode bloedcellen en bloedplasma) ook worden gemeten door fluorescentielevensbeeldvorming37, die profiteert van de unieke fotofysische eigenschappen van de vasculatuur en een nuttige aanvulling vormt op de groeiende intravitale toolbox.
In dit protocol wordt een workflow beschreven voor de segmentatie van vierdimensionale (4D) intravitale beeldvorming expliciet met behulp van intrinsieke signalen zoals endogene fluorescentie en SHG van acquisitie tot analyse. Dit protocol is met name relevant voor longitudinale studies door middel van een borstbeeldvormingsvenster waar exogene fluorescentie mogelijk niet praktisch of mogelijk is, zoals het geval is met PDX-modellen. De segmentatieprincipes die hier worden beschreven, zijn echter breed toepasbaar op intravitale gebruikers die tumorbiologie, weefselontwikkeling of zelfs normale weefselfysiologie onderzoeken. De gerapporteerde reeks analysebenaderingen stelt de gebruikers in staat om cellulair gedrag te differentiëren tussen regio’s van uitgelijnde of willekeurige collageenvezelconfiguraties, aantallen of gedragingen van cellen te vergelijken die zich in specifieke regio’s van de tumormicro-omgeving bevinden en de vasculatuur in kaart te brengen met behulp van alleen labelvrij of intrinsiek signaal. Samen creëren deze methoden een operationeel kader voor het maximaliseren van de diepte van informatie die wordt verkregen uit 4D intravitale beeldvorming van de borstklier, terwijl de behoefte aan extra exogene labels wordt geminimaliseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D intravitale beeldvorming is een krachtig hulpmiddel om dynamische fysiologische interacties te onderzoeken binnen de ruimtelijke en temporele context van de inheemse tumormicro-omgeving. Dit manuscript biedt een zeer basaal en aanpasbaar operationeel kader om dynamische celinteracties binnen de tumormassa, het aangrenzende stroma of in de nabijheid van het vasculaire netwerk te compartimenteren met alleen endogene signalen van de tweede harmonische generatie of NAD (P) H-autofluorescentie. Dit protocol biedt een uitge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag NCI R01 CA216248, CA206458 en CA179556 subsidies erkennen voor de financiering van dit werk. We willen ook Dr. Kevin Eliceiri en zijn beeldvormingsgroep bedanken voor hun technische expertise in de vroege ontwikkeling van ons intravitale programma. We bedanken ook Dr. Ben Cox en andere leden van de Eliceiri Fabrication Group van het Morgridge Institute for Research voor hun essentiële technische ontwerp tijdens de vroege fasen van de MIW. Dr. Ellen Dobson assisteerde bij nuttige gesprekken over de ImageJ trainbare WEKA segmentatietool. Daarnaast willen we Dr. Melissa Skala en Dr. Alexa Barres-Heaton bedanken voor het tijdige gebruik van hun microscoop. Tot slot willen we Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, bedanken voor alle doordachte discussies en adviezen over onze muisbehandeling en -verzorging.
Materials
| #1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
| 1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
| 20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
| 27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
| 40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
| 5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
| Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
| Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
| cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
| fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
| forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
| GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
| heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
| heating chamber | home built | ||
| Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| inverted microscope base | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
| Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
| Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
| NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
| objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
| Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
| SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
| surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
| surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
| Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
| TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
| Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
| two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
| ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
| Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |
References
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
- Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
- Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
- Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
- Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
- Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
- Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
- Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
- Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
- Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
- Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
- Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
- Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
- Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
- Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
- Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
- Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
- Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), 925-938 (2013).
- Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
- You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
- Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
- Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
- Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
- Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
- Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
- Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
