El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.
La capacidad de visualizar interacciones fisiológicas complejas y dinámicas entre numerosos tipos de células y la matriz extracelular (ECM) dentro de un microambiente tumoral vivo es un paso importante hacia la comprensión de los mecanismos que regulan la progresión del tumor. Si bien esto se puede lograr a través de las técnicas actuales de imágenes intravitales, sigue siendo un desafío debido a la naturaleza heterogénea de los tejidos y la necesidad de contexto espacial dentro de la observación experimental. Con este fin, hemos desarrollado un flujo de trabajo de imágenes intravitales que combina imágenes de segunda generación armónica de colágeno, fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H y microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) como un medio para compartimentar no invasivamente el microambiente tumoral en dominios básicos del nido tumoral, el estroma circundante o ECM, y la vasculatura. Este protocolo no invasivo detalla el proceso paso a paso que va desde la adquisición de imágenes de lapso de tiempo de modelos de tumores mamarios hasta el análisis de posprocesamiento y la segmentación de imágenes. La principal ventaja de este flujo de trabajo es que explota las firmas metabólicas para contextualizar el microambiente tumoral vivo que cambia dinámicamente sin el uso de etiquetas fluorescentes exógenas, lo que lo hace ventajoso para los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes humanos (PDX) y el uso clínico futuro donde los fluoróforos extrínsecos no son fácilmente aplicables.
Se sabe que la matriz extracelular (ECM) en el microambiente tumoral se deposita y remodela dinámicamente por múltiples tipos de células para facilitar aún más la progresión de la enfermedad 1,2,3. Estas alteraciones de la matriz proporcionan señales mecánicas y biológicas que alteran el comportamiento celular y, a menudo, resultan en un ciclo continuo de remodelación de la matriz4. La investigación sobre la interacción dinámica y recíproca entre las células tumorales y la matriz extracelular a menudo se lleva a cabo utilizando sistemas tridimensionales (3D) de cultivo in vitro o microfluídicos. Si bien estos enfoques de abajo hacia arriba han demostrado mecanismos de remodelación de la ECM 5,6,7, aumento de la proliferación 8, transición epitelial a mesenquimal 9,10,11,12 y migración e invasión de células tumorales 7,13,14,15,16 , su enfoque se ha centrado principalmente en unos pocos tipos de células (por ejemplo, células tumorales o fibroblastos) dentro de una matriz 3D homogénea en comparación con la diversidad y heterogeneidad de las interacciones presentes dentro de un tejido fisiológico. Además de los sistemas in vitro, la histología tumoral ex vivo también puede proporcionar cierta información sobre estas interacciones célula-célula y célula-ECM17. La inmunohistoquímica tiene la ventaja de poder analizar múltiples tipos de células con respecto a la composición espacialmente heterogénea y la arquitectura de la ECM, pero los puntos finales estáticos del tejido fijo no capturan la naturaleza dinámica de las interacciones entre las células y el microambiente. Las imágenes intravitales han abierto la puerta a interrogar interacciones diversas y dinámicas dentro del contexto fisiológico del microambiente tumoral nativo.
Las capacidades de las imágenes tumorales intravitales están avanzando rápidamente. Las mejoras en el diseño de ventanas de imágenes y las técnicas quirúrgicas para implantar las ventanas han permitido la obtención de imágenes tumorales longitudinales a largo plazo en una variedad de ubicaciones anatómicas (es decir, tumor primario, ganglios linfáticos, sitios metastásicos 18,19,20). Además, la capacidad de la instrumentación óptica para visualizar y recopilar datos en múltiples dimensiones (es decir, espectral, intensidad de fluorescencia espacial y vida útil), y a alta resolución y velocidad (velocidad de video) se está volviendo ampliamente accesible. La tecnología mejorada brinda la oportunidad de explorar cambios rápidos en la señalización celular y la dinámica fenotípica dentro de un entorno fisiológico. Por último, la expansión de las herramientas optogenéticas y la amplia gama de construcciones fluorescentes genéticas permiten el etiquetado de tipos celulares específicos para capturar la migración celular en el microambiente tumoral o el rastreo del linaje celular durante el desarrollo o la progresión de la enfermedad21,22. El uso de estas herramientas en combinación con la tecnología CRISPR / Cas9 brinda a los investigadores la oportunidad de generar modelos animales únicos de manera oportuna.
Si bien todos estos avances hacen que las imágenes intravitales sean un método cada vez más poderoso para explorar las interacciones celulares dinámicas y fisiológicas, todavía existe una necesidad importante de desarrollar estrategias que proporcionen un contexto espacial, temporal y estructural a nivel tisular a estas interacciones biológicas. Actualmente, muchos estudios de imágenes intravitales compensan la falta de puntos de referencia visuales, como los vasos sanguíneos, inyectando tintes fluorescentes en la vasculatura o empleando modelos de ratón que expresan exógenamente proteínas fluorescentes para delinear las características físicas. Los colorantes inyectables y los sustratos como el dextrans fluorescente se utilizan ampliamente para etiquetar con éxito la vasculatura en colecciones intravitales19, 23, 24. Sin embargo, este enfoque no está exento de limitaciones. Por un lado, requiere manipulaciones adicionales del ratón y su utilidad se limita a experimentos a corto plazo. Para estudios longitudinales, el dextrano fluorescente puede ser problemático ya que observamos la acumulación de dextrano en las células fagocíticas o la difusión en el tejido circundante a lo largo del tiempo25. La incorporación de proteína fluorescente exógena en el modelo de ratón se ha presentado como una alternativa al dextrans fluorescente pero presenta limitaciones propias. La disponibilidad y diversidad de fluoróforos exógenos dentro de los modelos de ratón siguen siendo limitadas y costosas de crear. Además, en modelos específicos, como los modelos PDX, las manipulaciones genéticas no son deseables ni posibles. También se ha demostrado que la presencia de proteínas fluorescentes o bioluminiscentes dentro de las células se reconocen como extrañas dentro del ratón, y dentro de los modelos de ratón inmunocompetentes, esto reduce la cantidad de metástasis debido a la respuesta del sistema inmune huésped26,27. Por último, las proteínas fluorescentes exógenas o los colorantes fluorescentes utilizados para el contexto espacial o para segmentar datos posteriores a menudo ocupan rangos primos del espectro de luz que de otro modo podrían usarse para investigar las interacciones fisiológicas de interés.
El uso de la señal intrínseca de la ECM o fluorescencia endógena de las células dentro del tejido representa un medio potencial universal sin etiquetas para segmentar los datos intravitales para un análisis celular y espacial más profundo. La segunda generación armónica (SHG) se ha utilizado durante mucho tiempo para visualizar el ECM28. Con el posterior desarrollo de herramientas importantes para ayudar en la caracterización de la organización de la fibra 29,30,31, es posible caracterizar el comportamiento celular en relación con la estructura local de ECM. Además, la autofluorescencia del metabolito endógeno, NAD(P)H, proporciona otra herramienta sin etiquetas para compartimentar el microambiente tumoral in vivo. NAD(P)H fluorescencia intensamente en las células tumorales y se puede utilizar para discriminar los límites del nido tumoral en crecimiento de su estroma circundante21,32. Por último, la vasculatura es una estructura fisiológica importante en el microambiente tumoral y el sitio de interacciones clave específicas del tipo celular 33,34,35. La excitación de los glóbulos rojos (RBC) o plasma sanguíneo se ha utilizado para visualizar la vasculatura tumoral, y utilizando la excitación de dos o tres fotones (2P; 3P) se ha demostrado que la medición de las tasas de flujo sanguíneo es posible36. Sin embargo, mientras que los vasos sanguíneos más grandes son fácilmente identificables por sus firmas de fluorescencia endógena, la identificación de vasos sanguíneos pequeños sutiles, variables y menos fluorescentes requiere más experiencia. Estas dificultades inherentes dificultan la segmentación óptima de la imagen. Afortunadamente, estas fuentes de fluorescencia endógena (es decir, glóbulos rojos y plasma sanguíneo) también se pueden medir mediante imágenes de fluorescencia de por vida37, que capitalizan las propiedades fotofísicas únicas de la vasculatura y representan una adición útil a la creciente caja de herramientas intravital.
En este protocolo, se describe un flujo de trabajo para la segmentación de imágenes intravitales de cuatro dimensiones (4D) utilizando explícitamente señales intrínsecas como la fluorescencia endógena y SHG desde la adquisición hasta el análisis. Este protocolo es particularmente pertinente para estudios longitudinales a través de una ventana de imágenes mamarias donde la fluorescencia exógena puede no ser práctica o posible, como es el caso de los modelos PDX. Los principios de segmentación descritos aquí, sin embargo, son ampliamente aplicables a los usuarios intravitales que investigan la biología tumoral, el desarrollo de tejidos o incluso la fisiología normal de los tejidos. El conjunto de enfoques de análisis reportado permitirá a los usuarios diferenciar el comportamiento celular entre regiones de configuraciones de fibra de colágeno alineadas o aleatorias, comparar números o comportamientos de células que residen en regiones específicas del microambiente tumoral y mapear la vasculatura al microambiente tumoral utilizando solo señal intrínseco o sin etiquetas. Juntos, estos métodos crean un marco operativo para maximizar la profundidad de la información obtenida de las imágenes intravitales 4D de la glándula mamaria al tiempo que minimizan la necesidad de etiquetas exógenas adicionales.
La imagen intravital 4D es una herramienta poderosa para investigar interacciones fisiológicas dinámicas dentro del contexto espacial y temporal del microambiente tumoral nativo. Este manuscrito proporciona un marco operativo muy básico y adaptable para compartimentar las interacciones celulares dinámicas dentro de la masa tumoral, el estroma adyacente o dentro de la proximidad a la red vascular utilizando solo señales endógenas de segunda generación armónica o autofluorescencia NAD(P)H. Este protocolo proporcion…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer las subvenciones del NCI R01 CA216248, CA206458 y CA179556 por financiar este trabajo. También nos gustaría agradecer al Dr. Kevin Eliceiri y su grupo de imágenes por su experiencia técnica en el desarrollo temprano de nuestro programa intravital. También agradecemos al Dr. Ben Cox y a otros miembros del Grupo de Fabricación Eliceiri en el Instituto Morgridge de Investigación por su diseño técnico esencial durante las primeras fases del MIW. Ellen Dobson ayudó con conversaciones útiles sobre la herramienta de segmentación WEKA entrenable ImageJ. Además, nos gustaría agradecer a la Dra. Melissa Skala y a la Dra. Alexa Barres-Heaton por el uso oportuno de su microscopio. Por último, nos gustaría agradecer a la Dra. Brigitte Raabe, D.V.M, por todas las discusiones reflexivas y consejos sobre nuestro manejo y cuidado del ratón.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |