La transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis es un método de lesión relevante para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal mediante la realización de un corte transversal que corta completamente la médula espinal a nivel torácico.
La lesión de la médula espinal (LME) es una aflicción permanente, que afecta los nervios motores y sensoriales del sistema nervioso central (SNC), lo que resulta en parálisis debajo del sitio de la lesión. Hasta la fecha, no existe una terapia de recuperación funcional para la LME, y hay una falta de claridad con respecto a los muchos complejos y eventos dinámicos que ocurren después de la LME. Muchos organismos no mamíferos pueden regenerarse después de una LME grave, como los peces teleósteos, los anfibios urodele y las etapas larvales de los anfibios anuros, incluidos los renacuajos Xenopus laevis . Estos son organismos modelo de buena fe para estudiar y comprender la respuesta a la LME y los mecanismos subyacentes a los procesos regenerativos exitosos. Este tipo de investigación puede conducir a la identificación de posibles dianas para la intervención terapéutica de LME. Este artículo describe cómo realizar la transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis , incluida la cría, la cirugía, la atención posterior a la cirugía y la evaluación de pruebas funcionales. Este método de lesión se puede aplicar para dilucidar los diferentes pasos de la regeneración de la médula espinal mediante el estudio de los mecanismos celulares, moleculares y genéticos, así como la evolución histológica y funcional después de la LME y durante la regeneración de la médula espinal.
La lesión de la médula espinal (LME) es una aflicción que afecta aproximadamente a 250,000-500,000 personas en todo el mundo cada año1. Además de esta alta prevalencia, la LME afecta a los nervios sensoriales y motores, generando parálisis debajo del sitio de la lesión y desconexión de algunos órganos internos del control del SNC. La médula espinal, una parte del SNC, no puede regenerarse, y debido a la complejidad de la aflicción y la falta de comprensión completa de todos los procesos involucrados, todavía no hay terapias eficientes que permitan la recuperación funcional.
Los organismos no mamíferos, como los peces teleósteos, los anfibios urodele y las etapas larvales de los anfibios anuros, que pueden regenerar la médula espinal después de una SCI2 grave,3,4, son excelentes organismos modelo para estudiar los procesos que gobiernan un evento regenerativo exitoso y comprender el fracaso de la regeneración de los mamíferos. Esta comprensión es de gran interés, ya que podría proporcionar información original para desarrollar nuevas dianas terapéuticas y posibles terapias para la LME.
La rana anuro, Xenopus laevis, es un excelente organismo modelo para estudiar la LME. Tiene excelentes capacidades regenerativas durante las etapas de renacuajo, que se pierden progresivamente durante la metamorfosis, permitiendo la experimentación en las etapas regenerativa y no regenerativa3,5. El método de lesión establecido para el estudio de la LME en renacuajos Xenopus laevis consiste en la amputación de la cola, donde se extirpa toda la cola, incluyendo tejidos como el músculo, la notocorda y la médula espinal6. Este enfoque ha sido fundamental en la comprensión de los mecanismos generales de los procesos regenerativos4,7,8,9,10.
Como la amputación de la cola involucra múltiples tejidos además de la médula espinal, que es diferente de lo que sucede después de la LME humana, se necesita un paradigma de lesión más relevante para el estudio de la LME. Nos hemos basado en estudios utilizados en el pasado11 para generar descripciones exhaustivas de paradigmas de lesión5,12,13,14 y diferentes métodos para el estudio de SCI12,13,14,15,16,17,18 . Después de la transección de la médula espinal, la porción caudal de la médula espinal se puede aislar para la expresión de ARN y proteínas y análisis de alto rendimiento14,19,20,21. Adicionalmente, las inyecciones intracelómicas de fármacos y moléculas pequeñas, así como la electroporación de ADNc, ARN o morfolinos, antes o después de la transección medular, permiten estudiar los efectos de estas moléculas en la prevención o tratamiento de la LME o de eventos específicos ocurridos después de la LME y la regeneración de la médula espinal13,14 . Además, la evolución de la lesión y los procesos regenerativos se pueden estudiar en diferentes momentos después de la lesión utilizando enfoques bioquímicos, moleculares, histológicos y funcionales12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Por último, todas las técnicas mencionadas pueden ser utilizadas en etapas no regenerativas, destacando una de las ventajas más importantes de utilizar Xenopus laevis como organismo modelo para estudiar sci, los estudios comparativos de mecanismos regenerativos y no regenerativos en una misma especie13,19,20,21,22. Este artículo presenta un protocolo para la transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis, comenzando con la estadificación y selección de los renacuajos regenerativos de Nieuwkoop y Faber (NF) etapa 50. Esto es seguido por la descripción de los procedimientos para la cirugía de la médula espinal para producir animales simulados y transectados, la atención postquirúrgica y, finalmente, el análisis de la recuperación funcional mediante la medición de la distancia de natación del renacuajo libre.
El protocolo descrito en este documento es un excelente método para realizar SCI y evaluar la recuperación funcional. Para la reproducibilidad, es esencial cultivar renacuajos sanos y elegir animales que sean similares en tamaño. La falta de una alimentación adecuada genera estrés nutricional, lo que se traduce en escasas capacidades regenerativas26; por lo tanto, se debe prestar especial atención a la alimentación con renacuajos. A medida que los renacuajos alcanzan la etapa 50 después de 3-4 semanas, pueden criarse a temperaturas más altas para acelerar el proceso de crecimiento, siendo óptimo 18-25 °C27. La calidad del agua es importante, ya que los animales son sensibles a las condiciones del agua y a los productos químicos. Las condiciones óptimas del agua incluyen el uso de agua filtrada con carbón y libre de cloro con los siguientes parámetros: pH (6.5-7.5), cloruro (<0.02 mg / L), conductividad del agua (1.0 mS / cm ± 0.1 unidades), cobre (<0.3 mg / L); dureza del carbonato (KH: 5-10 dKH); dureza general (GH: 6-16 dGH); nitrato (NO3: <20 mg/L); y nitrito (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. Además, para evitar la contaminación, los tanques de plástico deben limpiarse una vez a la semana para criar animales o cada dos días después de la cirugía lavándose bien con agua sin cloruro y una esponja; debe evitarse el detergente.
Para una mejor tasa de supervivencia después de la cirugía, los renacuajos no deben exponerse a la anestesia durante largos períodos (no más de 2 min). Además, se recomienda anestesiar un renacuajo a la vez. Como los animales necesitan mantenerse hidratados, mantenga a los animales inmersos en solución todo el tiempo antes y después de la cirugía, y vierta la solución con una cuchara sobre el renacuajo antes de comenzar la cirugía. Asegúrese de que el daño sea lo suficientemente extenso como para cubrir toda la médula espinal, pero no demasiado extenso, ya que puede inducir una recuperación funcional deficiente o la muerte. Si la notocorda está dañada, el animal se doblará y la recuperación funcional se verá afectada. Si el daño se extiende más allá de la notocorda, la probabilidad de muerte aumenta14. Durante el ensayo de natación, la grabación se considera correcta si el software identifica a cada animal con una sombra azul; de lo contrario, la grabación debe repetirse. Es importante evitar el movimiento y los cambios de aire o luz durante el proceso de grabación para evitar errores de grabación.
Todavía hay muchas preguntas abiertas sobre los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al daño y la regeneración de la médula espinal. El protocolo descrito en este trabajo se puede utilizar para estudiar la contribución de diferentes eventos celulares, expresión génica y tratamientos sobre la recuperación funcional, determinados mediante la medición de las capacidades de natación. Además, se pueden aplicar muchas otras técnicas a los animales operados. La médula espinal puede aislarse para realizar extracción de proteínas y/o ARNm14 para estudiar perfiles de expresión proteica y génica tras daño y tratamiento19,20. Esta cirugía también ha sido la base para estudiar la respuesta celular de la médula espinal22 y el comportamiento de las células progenitoras madre neurales12,13,22 después de una lesión medular. Las cascadas de señalización implicadas en la regeneración de la médula espinal también se han estudiado utilizando el paradigma del daño medular descrito en este documento23. En resumen, el protocolo aquí descrito es un excelente modelo para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal y se ha utilizado para muchos estudios que han contribuido al conocimiento existente sobre el tema.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por becas de investigación de: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
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Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |