Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie is een relevante letselmethode om dwarslaesie en regeneratie te bestuderen door een dwarse snede te maken die het ruggenmerg volledig doorsnijdt op thoracale niveau.
Dwarslaesie (SCI) is een permanente aandoening, die de motorische en sensorische zenuwen van het centrale zenuwstelsel (CZS) aantast, wat resulteert in verlamming onder de plaats van het letsel. Tot op heden is er geen functionele hersteltherapie voor dwarslaesie en is er een gebrek aan duidelijkheid over de vele complexen en dynamische gebeurtenissen die zich voordoen na dwarslaesie. Veel niet-zoogdierorganismen kunnen regenereren na ernstige dwarslaesie, zoals teleostvissen, ongeroerde amfibieën en larvale stadia van anuran amfibieën, waaronder Xenopus laevis kikkervisjes. Dit zijn bonafide modelorganismen om de reactie op dwarslaesie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan succesvolle regeneratieve processen te bestuderen en te begrijpen. Dit type onderzoek kan leiden tot de identificatie van potentiële doelwitten voor sci-therapeutische interventie. In dit artikel wordt beschreven hoe u Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie uitvoert, inclusief houderij, chirurgie, postoperatieve zorg en functionele testevaluatie. Deze verwondingsmethode kan worden toegepast voor het ophelderen van de verschillende stappen van spinale regeneratie door het bestuderen van de cellulaire, moleculaire en genetische mechanismen, evenals histologische en functionele evolutie na dwarslaesie en tijdens regeneratie van het ruggenmerg.
Dwarslaesie (SCI) is een aandoening die elk jaar wereldwijd ongeveer 250.000-500.000 mensen treft1. Naast deze hoge prevalentie beïnvloedt SCI sensorische en motorische zenuwen, waardoor verlamming onder de verwondingsplaats wordt gegenereerd en sommige interne organen worden losgekoppeld van de controle van het CZS. Het ruggenmerg, een deel van het CZS, kan niet regenereren en vanwege de complexiteit van de aandoening en het gebrek aan volledig begrip van alle betrokken processen, zijn er nog steeds geen efficiënte therapieën die functioneel herstel mogelijk maken.
Niet-zoogdierorganismen, zoals teleostvissen, amfibieën en larvale stadia van anuran amfibieën, die het ruggenmerg kunnen regenereren na ernstige SCI2,3,4, zijn uitstekende modelorganismen voor het bestuderen van de processen die een succesvolle regeneratieve gebeurtenis beheersen en het begrijpen van het falen van zoogdierregeneratie. Dit begrip is van groot belang omdat het originele inzichten kan bieden om nieuwe therapeutische doelen en mogelijke therapieën voor dwarslaesie te ontwikkelen.
De anurankikker, Xenopus laevis, is een uitstekend modelorganisme om dwarslaesie te bestuderen. Het heeft uitstekende regeneratieve capaciteiten tijdens de kikkervisstadia, die geleidelijk verloren gaan tijdens metamorfose, waardoor experimenten in de regeneratieve en niet-regeneratieve stadia mogelijk zijn3,5. De gevestigde verwondingsmethode voor het bestuderen van dwarslaesie bij Xenopus laevis kikkervisjes bestaat uit staartamputatie, waarbij de hele staart wordt verwijderd, inclusief weefsels zoals spieren, notochord en ruggenmerg6. Deze benadering heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van algemene mechanismen van regeneratieve processen4,7,8,9,10.
Omdat staartamputatie naast het ruggenmerg meerdere weefsels omvat, wat anders is dan wat er gebeurt na menselijke dwarslaesie, is een relevanter letselparadigma nodig voor de studie van dwarslaesie. We hebben vertrouwd op studies die in het verleden11 zijn gebruikt voor het genereren van uitgebreide beschrijvingen van letselparadigma’s5,12,13,14 en verschillende methoden voor de studie van SCI12,13,14,15,16,17,18 . Na ruggenmergtranssectie kan het caudale deel van het ruggenmerg worden geïsoleerd voor RNA- en eiwitexpressie en high-throughput analyses14,19,20,21. Bovendien maken intracelomic injecties van geneesmiddelen en kleine moleculen, evenals elektroporatie van cDNA, RNA of morfolineos, vóór of na ruggenmergtranssectie, de studie mogelijk van de effecten van deze moleculen bij de preventie of behandeling van dwarslaesie of van specifieke gebeurtenissen die optreden na dwarslaesie en regeneratie van het ruggenmerg13,14 . Verder kunnen de evolutie van de verwonding en de regeneratieve processen op verschillende tijdstippen na het letsel worden bestudeerd met behulp van biochemische, moleculaire, histologische en functionele benaderingen12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Ten slotte kunnen alle bovengenoemde technieken worden gebruikt in niet-regeneratieve stadia, wat een van de belangrijkste voordelen benadrukt van het gebruik van Xenopus laevis als een modelorganisme om SCI te bestuderen, de vergelijkende studies van regeneratieve en niet-regeneratieve mechanismen in dezelfde soort13,19,20,21,22. Dit artikel presenteert een protocol voor Xenopus laevis kikkervis ruggenmergtranssectie, te beginnen met de stadiëring en selectie van regeneratieve Nieuwkoop en Faber (NF) stadium 50 kikkervisjes. Dit wordt gevolgd door de beschrijving van de procedures voor ruggenmergchirurgie om schijn- en transected dieren te produceren, postoperatieve zorg en ten slotte de analyse van functioneel herstel door het meten van vrije kikkervisjes zwemafstand.
Het hierin beschreven protocol is een uitstekende methode om dwarslaesie uit te voeren en functioneel herstel te evalueren. Voor reproduceerbaarheid is het essentieel om gezonde kikkervisjes te kweken en dieren te kiezen die qua grootte vergelijkbaar zijn. Gebrek aan goede voeding genereert voedingsstress, wat resulteert in slechte regeneratieve capaciteiten26; daarom moet speciale aandacht worden besteed aan het voeren van kikkervisjes. Als kikkervisjes na 3-4 weken stadium 50 bereiken, kunnen ze bij hogere temperaturen worden gekweekt om het groeiproces te versnellen, waarbij 18-25 ° C optimaal is27. Waterkwaliteit is belangrijk, omdat dieren gevoelig zijn voor wateromstandigheden en chemische producten. De optimale watercondities omvatten het gebruik van koolstofgefilterd, chloorvrij water met de volgende parameters: pH (6,5-7,5), chloride (<0,02 mg / L), geleidbaarheid van water (1,0 mS / cm ± 0,1 eenheden), koper (<0,3 mg / L); carbonaathardheid (KH: 5-10 dKH); algemene hardheid (GH: 6-16 dGH); nitraat (NO3: <20 mg/L); en nitriet (NO2: <0,1 mg/l)14,27,28. Bovendien, om besmetting te voorkomen, moeten plastic tanks eenmaal per week worden gereinigd voor het fokken van dieren of om de andere dag na de operatie door grondig te wassen met chloridevrij water en een spons; wasmiddel moet worden vermeden.
Voor een betere overlevingskans na de operatie mogen kikkervisjes niet gedurende lange perioden (niet langer dan 2 minuten) aan anesthesie worden blootgesteld. Bovendien wordt aanbevolen om één kikkervisje tegelijk te verdoven. Omdat de dieren gehydrateerd moeten blijven, houdt u de dieren de hele tijd voor en na de operatie ondergedompeld in de oplossing en giet u de oplossing met een lepel op het kikkervisje voordat u aan de operatie begint. Zorg ervoor dat de schade uitgebreid genoeg is om het hele ruggenmerg te bedekken, maar niet te uitgebreid, omdat dit een slecht functioneel herstel of de dood kan veroorzaken. Als het notochord beschadigd is, zal het dier worden gebogen en zal het functionele herstel worden beïnvloed. Als de schade verder reikt dan het notochord, neemt de kans op overlijden toe14. Tijdens de zwemtest wordt de opname als correct beschouwd als de software elk dier identificeert met een blauwe schaduw; anders moet de opname worden herhaald. Het is belangrijk om beweging en lucht- of lichtveranderingen tijdens het opnameproces te vermijden om opnamefouten te voorkomen.
Er zijn nog veel open vragen over de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ruggenmergschade en regeneratie. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, kan worden gebruikt om de bijdrage van verschillende cellulaire gebeurtenissen, genexpressie en behandelingen op functioneel herstel te bestuderen, bepaald door het meten van zwemcapaciteiten. Daarnaast kunnen vele andere technieken worden toegepast op de geopereerde dieren. Het ruggenmerg kan worden geïsoleerd om eiwit- en/of mRNA-extractie14 uit te voeren om eiwit- en genexpressieprofielen na beschadiging en behandeling te bestuderen19,20. Deze operatie is ook de basis geweest voor het bestuderen van de cellulaire respons van het ruggenmerg22 en het gedrag van neurale stamvoorlopercellen12,13,22 na dwarslaesie. Signaleringscascades die betrokken zijn bij de regeneratie van het ruggenmerg zijn ook bestudeerd met behulp van het paradigma voor ruggenmergschade dat hierin wordt beschreven23. Samenvattend is het hier beschreven protocol een uitstekend model om dwarslaesie en regeneratie te bestuderen en is het gebruikt voor vele studies die hebben bijgedragen aan de bestaande kennis over het onderwerp.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door onderzoeksbeurzen van: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |