Xenopus laevis 올챙이 척수 transection은 흉부 수준에서 척수를 완전히 절단하는 횡단 절단을 만들어 척수 손상 및 재생을 연구하는 관련 손상 방법입니다.
척수 손상 (SCI)은 중추 신경계 (CNS) 운동 및 감각 신경에 영향을 미치는 영구적 인 고통으로 부상 부위 아래의 마비를 일으 킵니다. 현재까지 SCI에 대한 기능적 회복 요법은 없으며, SCI 이후에 발생하는 많은 복합체 및 동적 사건에 대한 명확성이 부족합니다. 많은 비 포유류 유기체는 텔레 오스트 물고기, 우로델 양서류 및 제노푸스 laevis 올챙이를 포함한 아누란 양서류의 애벌레 단계와 같은 심각한 SCI 후에 재생 될 수 있습니다. 이들은 SCI에 대한 반응과 성공적인 재생 과정의 기초가되는 메커니즘을 연구하고 이해하는 진정한 모델 유기체입니다. 이러한 유형의 연구는 SCI 치료 개입에 대한 잠재적 표적의 확인으로 이어질 수 있습니다. 이 기사에서는 축산, 수술, 수술 후 치료 및 기능 테스트 평가를 포함하여 Xenopus laevis 올챙이 척수 횡단을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 손상 방법은 세포, 분자 및 유전 적 메커니즘을 연구함으로써 척수 재생의 여러 단계를 해명하는 데뿐만 아니라 SCI 후 및 척수 재생 동안 조직 학적 및 기능적 진화를 해명하는 데 적용될 수 있습니다.
척수 손상 (SCI)은 매년 전 세계적으로 약 250,000-500,000 사람들에게 영향을 미치는 고통입니다1. 이러한 높은 유병률 외에도 SCI는 감각 및 운동 신경에 영향을 미쳐 부상 부위 아래에 마비를 일으키고 CNS의 제어에서 일부 내부 장기의 연결을 끊습니다. CNS의 일부인 척수는 재생이 불가능하며, 고통의 복잡성과 관련된 모든 과정에 대한 완전한 이해가 부족하기 때문에 기능적 회복을 허용하는 효율적인 치료법이 아직 없습니다.
중증 SCI2,3,4 후에 척수를 재생시킬 수 있는 텔레오스트 어류, 우로델 양서류 및 애벌레 단계와 같은 비포유류 유기체는 성공적인 재생 사건을 지배하는 과정을 연구하고 포유류 재생의 실패를 이해하기위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 이러한 이해는 SCI에 대한 새로운 치료 목표와 가능한 치료법을 개발하기위한 독창적 인 통찰력을 제공 할 수 있기 때문에 큰 관심사입니다.
아누란 개구리 인 Xenopus laevis는 SCI를 연구하는 훌륭한 모델 유기체입니다. 올챙이 단계에서 우수한 재생 능력을 가지고 있으며, 이는 변형 중에 점진적으로 손실되어 재생 및 비 재생 단계에서 실험을 허용합니다3,5. Xenopus laevis 올챙이에서 SCI를 연구하기위한 확립 된 부상 방법은 근육, notochord 및 척수와 같은 조직을 포함하여 꼬리 전체가 제거되는 꼬리 절단으로 구성됩니다6. 이 접근법은 재생 과정의 일반적인 메커니즘에 대한 이해에 도움이되었습니다4,7,8,9,10.
꼬리 절단은 척수 이외에 여러 조직을 포함하기 때문에 이는 인간 SCI 이후에 일어나는 일과 다르기 때문에 SCI의 연구에보다 관련성이 높은 손상 패러다임이 필요합니다. 우리는 부상 패러다임에 대한 포괄적 인 설명을 생성하기 위해 과거11에서 사용 된 연구에 의존했습니다.5,12,13,14 및 SCI12,13,14,15,16,17,18 연구를위한 다양한 방법 . 척수 절개 후, 척수의 꼬리 부분은 RNA 및 단백질 발현 및 고처리량 분석을 위해 단리될 수 있다14,19,20,21. 또한, 약물 및 소분자의 인트레이스롬성 주사뿐만 아니라 척수 횡단 전후에 cDNA, RNA 또는 모르폴리노의 전기천공은 SCI의 예방 또는 치료 또는 SCI 및 척수 재생 후에 발생하는 특정 사건에 대한 이러한 분자의 효과에 대한 연구를 가능하게 합니다13,14 . 또한, 부상 진화 및 재생 과정은 생화학적, 분자적, 조직학적, 기능적 접근법 12,13,14,17,19,20,21,22,23을 사용하여 부상 후 다른 타이밍에서 연구 될 수 있습니다.
마지막으로, 앞서 언급 한 모든 기술은 비 재생 단계에서 사용될 수 있으며, 동일한 종에서 재생 및 비 재생 메커니즘에 대한 비교 연구 인 SCI를 연구하기 위해 모델 유기체로 Xenopus laevis를 사용하는 가장 중요한 이점 중 하나를 강조합니다 13,19,20,21,22. 이 논문은 재생 Nieuwkoop 및 Faber (NF) 단계 50 올챙이의 준비 및 선택부터 시작하여 Xenopus laevis 올챙이 척수 횡단에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 가짜 및 횡단 동물을 생산하기위한 척수 수술의 절차, 수술 후 치료, 그리고 마지막으로 자유 올챙이 수영 거리의 측정에 의한 기능 회복의 분석에 대한 설명이 뒤 따른다.
본원에 기재된 프로토콜은 SCI를 수행하고 기능적 회복을 평가하는 우수한 방법이다. 재현성을 위해서는 건강한 올챙이를 키우고 크기가 비슷한 동물을 선택하는 것이 필수적입니다. 적절한 수유가 부족하면 영양 스트레스가 발생하여 재생 능력이 저하됩니다26; 따라서 올챙이 먹이기에 특별한주의를 기울여야합니다. 올챙이는 3-4 주 후에 50 단계에 도달하면 성장 과정을 가속화하기 위해 더 높은 온도에서 사육 될 수 있으며 18-25 ° C는 최적입니다27. 동물들은 수질 조건과 화학 제품에 민감하기 때문에 수질이 중요합니다. 최적의 물 조건은 pH (6.5-7.5), 염화물 (<0.02 mg / L), 물의 전도도 (1.0 mS / cm ± 0.1 단위), 구리 (<0.3 mg / L)의 매개 변수로 여과 된 염소가없는 물을 사용하는 것을 포함합니다. 탄산염 경도 (KH: 5-10 dKH); 일반적인 경도 (GH : 6-16 dGH); 질산염 (NO3: <20 mg/L); 및 아질산염 (NO2: <0.1 mg/L)14,27,28. 또한 오염을 피하기 위해 플라스틱 탱크는 동물을 기르기 위해 일주일에 한 번 청소하거나 수술 후 염화물이없는 물과 스폰지로 철저히 씻어서 청소해야합니다. 세제는 피해야합니다.
수술 후 더 나은 생존율을 위해, 올챙이는 오랜 기간 (2 분 이상) 마취에 노출되어서는 안됩니다. 또한 한 번에 하나의 올챙이를 마취하는 것이 좋습니다. 동물들은 수분을 유지해야하므로 수술 전후에 항상 동물을 용액에 담그고 수술을 시작하기 전에 올챙이 위에 숟가락으로 용액을 부으십시오. 손상이 전체 척수를 덮을만큼 충분히 광범위하지만 기능 회복이나 사망을 유발할 수 있으므로 너무 광범위하지 않은지 확인하십시오. notochord가 손상되면 동물이 구부러지고 기능 회복이 영향을받습니다. 피해가 노토코스를 넘어 확장되면 사망 확률이 증가합니다14. 수영 분석 중에 소프트웨어가 각 동물을 파란색 그림자로 식별하면 기록이 올바른 것으로 간주됩니다. 그렇지 않으면 녹음을 반복해야합니다. 녹음 과정에서 움직임과 공기 또는 빛의 변화를 피하여 녹음 실수를 방지하는 것이 중요합니다.
척수 손상과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 많은 공개 질문이 여전히 있습니다. 이 연구에 설명 된 프로토콜은 수영 능력을 측정하여 결정되는 기능 회복에 대한 다양한 세포 사건, 유전자 발현 및 치료법의 기여도를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 많은 다른 기술들이 조작된 동물에 적용될 수 있다. 척수는 단백질 및/또는 mRNA 추출14을 수행하여 손상 및 치료 후 단백질 및 유전자 발현 프로필을 연구하기 위해 단리될 수 있다19,20. 이 수술은 또한 척수 손상 후 척수 세포 반응22 및 신경 줄기 전구 세포12,13,22의 행동을 연구하기위한 기초가되었습니다. 척수 재생에 관여하는 신호전달 캐스케이드는 또한 본원에 기술된 척수 손상 패러다임을 사용하여 연구되었다23. 요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 척수 손상 및 재생을 연구하는 훌륭한 모델이며 주제에 대한 기존 지식에 기여한 많은 연구에 사용되었습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 PG Slater: FONDECYT N° 3190820의 연구 보조금으로 지원되었습니다. J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
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Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |