Xenopus laevis tadpole перетекания спинного мозга является соответствующим методом травмирования для изучения повреждения и регенерации спинного мозга путем поперечного разреза, который полностью разрывает спинной мозг на грудном уровне.
Травма спинного мозга (ТСМ) является постоянным заболеванием, которое влияет на двигательные и сенсорные нервы центральной нервной системы (ЦНС), что приводит к параличу под местом травмы. На сегодняшний день не существует функциональной восстановительной терапии при ТСМ, и отсутствует ясность в отношении многих комплексов и динамических событий, происходящих после ТСМ. Многие немлекопитающие организмы могут регенерировать после тяжелой ТСМ, такие как телеостные рыбы, амфибии уроделе и личиночные стадии амфибий анурана, включая головастиков Xenopus laevis . Это настоящие модельные организмы для изучения и понимания реакции на ТСМ и механизмов, лежащих в основе успешных регенеративных процессов. Этот тип исследований может привести к выявлению потенциальных целей для терапевтического вмешательства ТСМ. В этой статье описывается, как выполнять трансекцию спинного мозга головастиков Xenopus laevis , включая животноводство, хирургию, послеоперационный уход и оценку функционального теста. Этот метод травмирования может быть применен для выяснения различных этапов регенерации спинного мозга путем изучения клеточных, молекулярных и генетических механизмов, а также гистологической и функциональной эволюции после ТСМ и во время регенерации спинного мозга.
Травма спинного мозга (ТСМ) – это заболевание, которое ежегодно поражает примерно 250 000-500 000 человек во всем мире1. В дополнение к этой высокой распространенности, ТСМ влияет на сенсорные и двигательные нервы, вызывая паралич под местом повреждения и отключение некоторых внутренних органов от контроля ЦНС. Спинной мозг, входящий в состав ЦНС, не может регенерировать, и из-за сложности недуга и отсутствия полного понимания всех вовлеченных процессов до сих пор нет эффективных методов лечения, позволяющих функционально восстановиться.
Немлекопитающие организмы, такие как телеостные рыбы, амфибии уроделе и личиночные стадии амфибий анурана, которые могут регенерировать спинной мозг после тяжелой ТСМ2,3,4, являются отличными модельными организмами для изучения процессов, которые управляют успешным регенеративным событием и понимания неудачи регенерации млекопитающих. Это понимание представляет большой интерес, поскольку оно может дать оригинальную информацию для разработки новых терапевтических целей и возможных методов лечения ТСМ.
Анурановая лягушка, Xenopus laevis, является отличным модельным организмом для изучения ТСМ. Обладает отличными регенеративными способностями на стадиях головастиков, которые постепенно теряются во время метаморфоз, что позволяет экспериментировать на регенеративной и нерегенеративной стадиях3,5. Установленный метод травмирования для изучения ТСМ у головастиков Xenopus laevis состоит из ампутации хвоста, при которой удаляется весь хвост, включая такие ткани, как мышцы, нотохорда и спинной мозг6. Этот подход сыграл важную роль в понимании общих механизмов регенеративных процессов4,7,8,9,10.
Поскольку ампутация хвоста включает в себя несколько тканей в дополнение к спинному мозгу, что отличается от того, что происходит после ТСМ человека, для изучения ТСМ необходима более актуальная парадигма травмы. Мы опирались на исследования, использованные в прошлом11 для получения исчерпывающих описаний парадигм травм5,12,13,14 и различных методов изучения SCI12,13,14,15,16,17,18 . После трансекции спинного мозга каудальная часть спинного мозга может быть выделена для экспрессии РНК и белка и высокопроизводительных анализов14,19,20,21. Кроме того, интрацеломные инъекции лекарств и малых молекул, а также электропорация кДНК, РНК или морфолино до или после трансекции спинного мозга позволяют изучать влияние этих молекул на профилактику или лечение ТСМ или конкретных событий, происходящих после ТСМ и регенерации спинного мозга13,14 . Кроме того, эволюция травм и регенеративные процессы могут быть изучены в разное время после травмы с использованием биохимического, молекулярного, гистологического и функционального подходов12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Наконец, все вышеупомянутые методики могут быть использованы на нерегенеративных стадиях, подчеркивая одно из важнейших преимуществ использования Xenopus laevis в качестве модельного организма для изучения ТСМ, сравнительных исследований регенеративных и нерегенеративных механизмов у одних и тех же видов13,19,20,21,22. В данной работе представлен протокол трансекции спинного мозга головастиков Xenopus laevis, начиная со стадии и отбора регенеративных головастиков Nieuwkoop и Faber (NF) стадии 50. Далее следует описание процедур хирургии спинного мозга для получения фиктивных и трансективных животных, послеоперационный уход и, наконец, анализ функционального восстановления путем измерения расстояния плавания свободного головастика.
Протокол, описанный здесь, является отличным методом для выполнения ТСМ и оценки функционального восстановления. Для воспроизводимости важно выращивать здоровых головастиков и выбирать животных, похожих по размеру. Отсутствие надлежащего кормления порождает питательный стресс, что приводит к снижению регенеративных способностей26; поэтому особое внимание следует уделить кормлению головастиков. Когда головастики достигают стадии 50 через 3-4 недели, их можно выращивать при более высоких температурах для ускорения процесса роста, причем оптимально 18-25 ° C27. Качество воды важно, так как животные чувствительны к водным условиям и химическим продуктам. Оптимальные условия воды включают использование отфильтрованной углерода, безхлорной воды со следующими параметрами: рН (6,5-7,5), хлорид (<0,02 мг/л), проводимость воды (1,0 мСм/см ± 0,1 единицы), медь (<0,3 мг/л); карбонатная твердость (KH: 5-10 dKH); общая твердость (GH: 6-16 dGH); нитрат (NO3: <20 мг/л); и нитрит (NO2: <0,1 мг/л)14,27,28. Кроме того, во избежание загрязнения пластиковые емкости следует чистить один раз в неделю для выращивания животных или через день после операции, тщательно промывая безхлоридной водой и губкой; моющих средств следует избегать.
Для лучшей выживаемости после операции головастики не должны подвергаться анестезии в течение длительных периодов времени (не более 2 мин). Более того, рекомендуется обезболивать по одному головастику за раз. Поскольку животные должны оставаться гидратированными, держите животных погруженными в раствор все время до и после операции и вылейте раствор ложкой поверх головастика перед началом операции. Убедитесь, что повреждение достаточно обширно, чтобы охватить весь спинной мозг, но не слишком обширно, так как оно может вызвать плохое функциональное восстановление или смерть. Если нотохорд поврежден, животное будет согнуто, и будет нарушено функциональное восстановление. Если повреждение выходит за пределы нотохорды, вероятность летального исхода возрастает14. Во время плавательного анализа запись считается правильной, если программное обеспечение идентифицирует каждое животное с синей тенью; в противном случае запись должна быть повторена. Важно избегать движения и изменения воздуха или света во время процесса записи, чтобы предотвратить ошибки записи.
Есть еще много открытых вопросов о клеточных и молекулярных механизмах, лежащих в основе повреждения и регенерации спинного мозга. Протокол, описанный в этой работе, может быть использован для изучения вклада различных клеточных событий, экспрессии генов и лечения в функциональное восстановление, определяемое путем измерения способности к плаванию. Кроме того, многие другие методы могут быть применены к оперируемым животным. Спинной мозг может быть выделен для выполнения экстракции белка и/или мРНК14 для изучения профилей экспрессии белка и генов после повреждения и лечения19,20. Эта операция также послужила основой для изучения клеточного ответа спинного мозга22 и поведения нервных стволовых клеток-предшественников12,13,22 после травмы спинного мозга. Сигнальные каскады, участвующие в регенерации спинного мозга, также были изучены с использованием парадигмы повреждения спинного мозга, описанной в настоящем документе23. Таким образом, протокол, описанный здесь, является отличной моделью для изучения травмы и регенерации спинного мозга и использовался для многих исследований, которые способствовали существующим знаниям о предмете.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась за счет исследовательских грантов от: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; Х. Ларраин: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |