טרנספורמציה של חוט השדרה קסנופוס לאביס ראשן היא שיטת פגיעה רלוונטית לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות על ידי ביצוע חתך רוחבי שמנתק לחלוטין את חוט השדרה ברמת בית החזה.
פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מחלה קבועה, המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית (CNS) על העצבים המוטוריים והחשיים, וכתוצאה מכך שיתוק מתחת לאתר הפציעה. עד כה, אין טיפול התאוששות פונקציונלי עבור SCI, ויש חוסר בהירות לגבי מתחמים רבים ואירועים דינמיים המתרחשים לאחר SCI. אורגניזמים רבים שאינם יונקים יכולים להתחדש לאחר SCI חמור, כגון דגי טלוסט, דו-חיים אורודלים ושלבי זחל של דו-חיים אנורים, כולל ראשי קסנופוס לאביס . אלה הם אורגניזמים מודל בתום לב ללמוד ולהבין את התגובה SCI ואת המנגנונים שבבסיס תהליכי התחדשות מוצלחים. סוג זה של מחקר יכול להוביל לזיהוי של מטרות פוטנציאליות להתערבות טיפולית SCI. מאמר זה מתאר כיצד לבצע העברת ראשן ראשן קסנופוס laevis חוט השדרה, כולל גידול, ניתוח, טיפול לאחר המוות, והערכה מבחן פונקציונלי. שיטת פגיעה זו יכולה להיות מיושמת להבהרת השלבים השונים של התחדשות חוט השדרה על ידי לימוד המנגנונים התאיים, המולקולריים והגנטיים, כמו גם אבולוציה היסטולוגית ותפקודית לאחר SCI ובמהלך התחדשות חוט השדרה.
פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מחלה המשפיעה על כ -250,000-500,000 אנשים ברחבי העולם מדי שנה1. בנוסף לשכיחות גבוהה זו, SCI משפיע על עצבים חושיים ומוטוריים, יצירת שיתוק מתחת לאתר הפציעה וניתוק של כמה איברים פנימיים משליטת מערכת העצבים המרכזית. חוט השדרה, המהווה חלק ממערכת העצבים המרכזית, אינו יכול להתחדש, ובשל מורכבות הסבל וחוסר הבנה מלאה של כל התהליכים המעורבים, עדיין אין טיפולים יעילים המאפשרים התאוששות תפקודית.
אורגניזמים שאינם יונקים, כגון דגי טלוסט, דו-חיים אורודל ושלבי זחל של דו-חיים אנורים, שיכולים לחדש את חוט השדרה לאחר SCI2,3,4 חמור, הם אורגניזמים מודל מצוינים לחקר התהליכים השולטים באירוע התחדשות מוצלח והבנת כישלון התחדשות היונקים. הבנה זו היא עניין רב כפי שהוא יכול לספק תובנות מקוריות לפתח יעדים טיפוליים חדשים וטיפולים אפשריים עבור SCI.
הצפרדע האנאורנית, קסנופוס לאביס, היא אורגניזם מודל מצוין לחקור SCI. יש לו יכולות התחדשות מצוינות בשלבי הראשן, אשר הולכים לאיבוד בהדרגה במהלך מטמורפוזה, המאפשר ניסויים בשלבים הרגנרטיביים והלא-דורניים 3,5. שיטת הפציעה שנקבעה לחקר SCI בראשני קסנופוס לאביס מורכבת מקטיעה של הזנב, שם מוסר הזנב כולו, כולל רקמות כגון שריר, נוטוקורד וחוט השדרה6. גישה זו סייעה להבנת מנגנונים כלליים של תהליכי התחדשות4,7,8,9,10.
כמו כריתת זנב כרוך רקמות מרובות בנוסף לחוט השדרה, אשר שונה ממה שקורה לאחר SCI אנושי, פרדיגמת פגיעה רלוונטית יותר נדרש לחקר SCI. הסתמכנו על מחקרים ששימשו ב-11 האחרונים ליצירת תיאורים מקיפים של פרדיגמות פציעה5,12,13,14 ושיטות שונות לחקר SCI12,13,14,14,15,16,17,18 . לאחר העברת חוט השדרה, החלק caudal של חוט השדרה יכול להיות מבודד עבור RNA וביטוי חלבון וניתוחים תפוקה גבוהה14,19,20,21. בנוסף, זריקות אינטרקלומיות של תרופות ומולקולות קטנות, כמו גם אלקטרופורציה של cDNA, RNA, או morpholinos, לפני או אחרי העברת חוט השדרה, לאפשר את המחקר של ההשפעות של מולקולות אלה במניעה או בטיפול של SCI או של אירועים ספציפיים המתרחשים לאחר SCI והתחדשות חוט השדרה13,14 . יתר על כן, ניתן ללמוד את התפתחות הפציעות ואת תהליכי ההתחדשות בתזמונים שונים לאחר פציעה באמצעות גישות ביוכימיות, מולקולריות, היסטולוגיות ותפקודיות12,13,14,17,17,19,20,20,21,22,23.
לבסוף, ניתן להשתמש בכל הטכניקות הנ”ל בשלבים שאינם מתחדשים, תוך הדגשת אחד היתרונות החשובים ביותר של שימוש בקסנופוס לאביס כאורגניזם מודל לחקר SCI, המחקרים ההשוואתיים של מנגנונים רגנרטיביים ולא מתחדשים באותו מין13,19,20,20,21,22. מאמר זה מציג פרוטוקול עבור קסנופוס laevis ראשן ראשן חוט השדרה טרנסקציה, החל בימוי ובחירה של ניווקופ רגנרטיבי ופייבר (NF) שלב 50 ראשנים. זה ואחריו תיאור של ההליכים לניתוחי חוט השדרה כדי לייצר בעלי חיים מזויפים ו transected, טיפול פוסט כירורגי, ולבסוף ניתוח של התאוששות תפקודית על ידי מדידת מרחק שחייה ראשן חינם.
הפרוטוקול המתואר בזאת הוא שיטה מצוינת לביצוע SCI ולהעריך התאוששות פונקציונלית. עבור רבייה, זה חיוני כדי לגדל ראשנים בריאים ולבחור בעלי חיים דומים בגודלם. חוסר האכלה נכונה מייצר מתח תזונתי, אשר גורם קיבולות התחדשות ירודות26; לכן, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת להאכלת ראשנים. כאשר הראשנים מגיעים לשלב 50 לאחר 3-4 שבועות, ניתן לגדל אותם בטמפרטורות גבוהות יותר כדי להאיץ את תהליך הצמיחה, 18-25 °C להיות אופטימלי27. איכות המים חשובה, שכן בעלי חיים רגישים לתנאי מים ומוצרים כימיים. תנאי המים האופטימליים כוללים שימוש במים מסוננים בפחמן וללא כלור עם הפרמטרים הבאים: pH (6.5-7.5), כלוריד (<0.02 מ"ג/ל'), מוליכות מים (1.0 מ"ק/ס"מ ± 0.1 יחידות), נחושת (<0.3 מ"ג/ליטר); קשיות פחמתית (KH: 5-10 dKH); קשיות כללית (GH: 6-16 dGH); חנקתי (NO3: <20 מ"ג /L); וניטריט (NO2: <0.1 מ"ג /L)14,27,28. בנוסף, כדי למנוע זיהום, מיכלי פלסטיק יש לנקות פעם בשבוע לגידול בעלי חיים או כל יומיים לאחר הניתוח על ידי כביסה יסודית עם מים ללא כלוריד וספוג; יש להימנע מחומר ניקוי.
עבור שיעור הישרדות טוב יותר לאחר הניתוח, ראשנים לא חייבים להיות חשופים להרדמה לתקופות ארוכות (לא יותר מ 2 דקות). יתר על כן, מומלץ להרדים ראשן אחד בכל פעם. כמו בעלי החיים צריכים להישאר hydrated, לשמור על בעלי החיים שקועים בתמיסה כל הזמן לפני ואחרי הניתוח, ויוצקים את הפתרון עם כפית על הראשן לפני תחילת הניתוח. ודא כי הנזק הוא נרחב מספיק כדי לכסות את חוט השדרה כולו אבל לא נרחב מדי כפי שהוא יכול לגרום התאוששות תפקודית לקויה או מוות. אם נוטוקורד ניזוק, החיה תהיה כפופה, וההתאוששות התפקודית תושפע. אם הנזק משתרע מעבר לנוטוקורד, ההסתברות למוות עולה 14. במהלך בדיקת השחייה, ההקלטה נחשבת נכונה אם התוכנה מזהה כל בעל חיים עם צל כחול; אחרת, יש לחזור על ההקלטה. חשוב להימנע משינויי תנועה ואוויר או אור במהלך תהליך ההקלטה כדי למנוע טעויות הקלטה.
יש עדיין שאלות פתוחות רבות על המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס הנזק לחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול המתואר בעבודה זו יכול לשמש לחקר תרומתם של אירועים תאיים שונים, ביטוי גנים וטיפולים על התאוששות תפקודית, שנקבעו על ידי מדידת יכולות שחייה. בנוסף, טכניקות רבות אחרות ניתן ליישם על בעלי החיים המופעלים. ניתן לבודד את חוט השדרה כדי לבצע מיצוי חלבון ו/או mRNA14 כדי לחקור פרופילי חלבון וביטוי גנים לאחר נזק וטיפול19,20. ניתוח זה היה גם הבסיס לחקר התגובה התאית של חוט השדרה22 ואת ההתנהגות של תאי אב גזע עצביים12,13,22 לאחר פגיעה בחוט השדרה. מפלי איתות המעורבים בהתחדשות חוט השדרה נחקרו גם באמצעות פרדיגמת הנזק לחוט השדרה המתוארת כאן ב-23. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן הוא מודל מצוין לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות ושימש למחקרים רבים שתרמו לידע הקיים בנושא.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר מ: PG סלייטר: FONDECYT N ° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |