La trascrizione del midollo spinale del girino Xenopus laevis è un metodo di lesione rilevante per studiare la lesione e la rigenerazione del midollo spinale effettuando un taglio trasversale che recide completamente il midollo spinale a livello toracico.
La lesione del midollo spinale (SCI) è un’afflizione permanente, che colpisce i nervi motori e sensoriali del sistema nervoso centrale (SNC), con conseguente paralisi sotto il sito della lesione. Ad oggi, non esiste una terapia di recupero funzionale per la SCI e vi è una mancanza di chiarezza riguardo ai molti complessi ed eventi dinamici che si verificano dopo la SCI. Molti organismi non mammiferi possono rigenerarsi dopo una grave SCI, come i pesci teleostei, gli anfibi urodele e gli stadi larvali degli anfibi anuri, compresi i girini Xenopus laevis . Si tratta di organismi modello in buona fede per studiare e comprendere la risposta alla SCI e i meccanismi alla base dei processi rigenerativi di successo. Questo tipo di ricerca può portare all’identificazione di potenziali bersagli per l’intervento terapeutico SCI. Questo articolo descrive come eseguire la transezione del midollo spinale del girino Xenopus laevis , tra cui allevamento, chirurgia, cure post-chirurgiche e valutazione del test funzionale. Questo metodo di lesione può essere applicato per chiarire le diverse fasi della rigenerazione del midollo spinale studiando i meccanismi cellulari, molecolari e genetici, nonché l’evoluzione istologica e funzionale dopo la SCI e durante la rigenerazione del midollo spinale.
La lesione del midollo spinale (SCI) è un’afflizione che colpisce circa 250.000-500.000 persone in tutto il mondo ogni anno1. Oltre a questa alta prevalenza, la SCI colpisce i nervi sensoriali e motori, generando paralisi sotto il sito della lesione e disconnessione di alcuni organi interni dal controllo del SNC. Il midollo spinale, una parte del SNC, non può rigenerarsi e, a causa della complessità dell’afflizione e della mancanza di una comprensione completa di tutti i processi coinvolti, non esistono ancora terapie efficienti che consentano il recupero funzionale.
Gli organismi non mammiferi, come i pesci teleostei, gli anfibi urodele e gli stadi larvali degli anfibi anuri, che possono rigenerare il midollo spinale dopo sci2,3,4 gravi, sono organismi modello eccellenti per studiare i processi che governano un evento rigenerativo di successo e comprendere il fallimento della rigenerazione dei mammiferi. Questa comprensione è di grande interesse in quanto potrebbe fornire approfondimenti originali per sviluppare nuovi bersagli terapeutici e possibili terapie per la SCI.
La rana anura, Xenopus laevis, è un eccellente organismo modello per studiare la SCI. Ha ottime capacità rigenerative durante gli stadi del girino, che si perdono progressivamente durante la metamorfosi, permettendo la sperimentazione negli stadi rigenerativi e non rigenerativi3,5. Il metodo di lesione stabilito per studiare la SCI nei girini xenopus laevis consiste nell’amputazione della coda, in cui viene rimossa l’intera coda, compresi tessuti come muscoli, notocorda e midollo spinale6. Questo approccio è stato determinante nella comprensione dei meccanismi generali dei processi rigenerativi4,7,8,9,10.
Poiché l’amputazione della coda coinvolge più tessuti oltre al midollo spinale, che è diverso da ciò che accade dopo la SCI umana, è necessario un paradigma di lesione più rilevante per lo studio della SCI. Ci siamo basati su studi utilizzati in passato11 per generare descrizioni complete dei paradigmi di lesione5,12,13,14 e diversi metodi per lo studio di SCI12,13,14,15,16,17,18 . Dopo la transezione del midollo spinale, la porzione caudale del midollo spinale può essere isolata per l’espressione di RNA e proteine e analisi ad alto rendimento14,19,20,21. Inoltre, le iniezioni intracelomiche di farmaci e piccole molecole, così come l’elettroporazione di cDNA, RNA o morfolino, prima o dopo la trasduzione del midollo spinale, consentono lo studio degli effetti di queste molecole nella prevenzione o nel trattamento della SCI o di eventi specifici che si verificano dopo sci e rigenerazione del midollo spinale13,14 . Inoltre, l’evoluzione della lesione e i processi rigenerativi possono essere studiati in tempi diversi dopo l’infortunio utilizzando approcci biochimici, molecolari, istologici e funzionali12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Infine, tutte le suddette tecniche possono essere utilizzate in fasi non rigenerative, evidenziando uno dei vantaggi più importanti dell’utilizzo di Xenopus laevis come organismo modello per studiare la SCI, gli studi comparativi dei meccanismi rigenerativi e non rigenerativi nelle stesse specie13,19,20,21,22. Questo documento presenta un protocollo per la transezione del midollo spinale del girino Xenopus laevis, a partire dalla stadiazione e selezione dei girini rigenerativi Nieuwkoop e Faber (NF) stadio 50. Segue la descrizione delle procedure per la chirurgia del midollo spinale per produrre animali finti e transettati, la cura postchirurgica e infine l’analisi del recupero funzionale mediante la misurazione della distanza di nuoto del girino libero.
Il protocollo qui descritto è un metodo eccellente per eseguire SCI e valutare il recupero funzionale. Per la riproducibilità, è essenziale coltivare girini sani e scegliere animali di dimensioni simili. La mancanza di un’alimentazione adeguata genera stress nutrizionale, che si traduce in scarse capacità rigenerative26; pertanto, è necessario prestare particolare attenzione all’alimentazione dei girini. Quando i girini raggiungono lo stadio 50 dopo 3-4 settimane, possono essere allevati a temperature più elevate per accelerare il processo di crescita, 18-25 ° C è ottimale27. La qualità dell’acqua è importante, poiché gli animali sono sensibili alle condizioni dell’acqua e ai prodotti chimici. Le condizioni ottimali dell’acqua includono l’utilizzo di acqua filtrata a carbone, priva di cloro con i seguenti parametri: pH (6,5-7,5), cloruro (<0,02 mg / L), conducibilità dell'acqua (1,0 mS / cm ± 0,1 unità), rame (<0,3 mg / L); durezza carbonatica (KH: 5-10 dKH); durezza generale (GH: 6-16 dGH); nitrato (NO3: <20 mg/L); e nitrito (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. Inoltre, per evitare la contaminazione, i serbatoi di plastica devono essere puliti una volta alla settimana per l’allevamento di animali o a giorni alterni dopo l’intervento chirurgico lavando accuratamente con acqua priva di cloruri e una spugna; il detergente deve essere evitato.
Per un migliore tasso di sopravvivenza dopo l’intervento chirurgico, i girini non devono essere esposti all’anestesia per lunghi periodi (non più di 2 minuti). Inoltre, si consiglia di anestetizzare un girino alla volta. Poiché gli animali hanno bisogno di rimanere idratati, tenere gli animali immersi in soluzione tutto il tempo prima e dopo l’intervento chirurgico e versare la soluzione con un cucchiaio sopra il girino prima di iniziare l’intervento chirurgico. Assicurarsi che il danno sia abbastanza esteso da coprire l’intero midollo spinale ma non troppo esteso in quanto può indurre uno scarso recupero funzionale o la morte. Se la notocorda è danneggiata, l’animale sarà piegato e il recupero funzionale sarà influenzato. Se il danno si estende oltre la notocorda, la probabilità di morte aumenta14. Durante il test di nuoto, la registrazione è considerata corretta se il software identifica ogni animale con un’ombra blu; in caso contrario, la registrazione deve essere ripetuta. È importante evitare movimenti e cambi di aria o luce durante il processo di registrazione per evitare errori di registrazione.
Ci sono ancora molte domande aperte sui meccanismi cellulari e molecolari alla base del danno e della rigenerazione del midollo spinale. Il protocollo descritto in questo lavoro può essere utilizzato per studiare il contributo di diversi eventi cellulari, espressione genica e trattamenti sul recupero funzionale, determinati misurando le capacità di nuoto. Inoltre, molte altre tecniche possono essere applicate agli animali operati. Il midollo spinale può essere isolato per eseguire l’estrazione di proteine e/o mRNA14 per studiare i profili di espressione proteica e genica dopo danni e trattamenti19,20. Questo intervento chirurgico è stato anche la base per studiare la risposta cellulare del midollo spinale22 e il comportamento delle cellule progenitrici staminali neurali12,13,22 dopo la lesione del midollo spinale. Anche le cascate di segnalazione coinvolte nella rigenerazione del midollo spinale sono state studiate utilizzando il paradigma del danno al midollo spinale descritto nel presente documento23. In sintesi, il protocollo qui descritto è un modello eccellente per studiare le lesioni e la rigenerazione del midollo spinale ed è stato utilizzato per molti studi che hanno contribuito alle conoscenze esistenti sull’argomento.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da assegni di ricerca di: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
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Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
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Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |