非洲爪蟾 蝌蚪脊髓横断术是一种相关的损伤方法,通过在胸腔水平上完全切断脊髓的横向切口来研究脊髓损伤和再生。
脊髓损伤(SCI)是一种永久性疾病,影响中枢神经系统(CNS)运动和感觉神经,导致损伤部位下方瘫痪。迄今为止,SCI尚无功能恢复疗法,并且对于SCI后发生的许多复合物和动态事件缺乏明确性。许多非哺乳动物生物可以在严重SCI后再生,例如硬骨鱼,乌洛德莱两栖动物和无性两栖动物的幼虫阶段,包括 非洲爪蟾 蝌蚪。这些是真正的模式生物,用于研究和理解对SCI的反应以及成功再生过程背后的机制。这种类型的研究可以导致确定SCI治疗干预的潜在靶点。本文介绍如何进行 非洲爪蟾 蝌蚪脊髓横断,包括饲养、手术、术后护理和功能测试评估。这种损伤方法可以通过研究SCI后和脊髓再生过程中的细胞,分子和遗传机制以及组织学和功能进化来阐明脊髓再生的不同步骤。
脊髓损伤 (SCI) 是一种每年影响全球约 250,000-500,000 人的疾病1。除了这种高患病率外,SCI还影响感觉和运动神经,在损伤部位下方产生麻痹,并使一些内脏器官与中枢神经系统的控制断开。脊髓是中枢神经系统的一部分,无法再生,并且由于痛苦的复杂性和对所有相关过程的缺乏完全理解,仍然没有有效的治疗方法允许功能恢复。
非哺乳动物生物,如硬骨鱼、乌贼两栖动物和两栖动物的幼虫阶段,在严重SCI2,3,4后可以再生脊髓,是研究控制成功再生事件的过程和了解哺乳动物再生失败的优秀模式生物。这种理解非常有趣,因为它可以为SCI开发新的治疗靶点和可能的治疗方法提供原创见解。
阿努兰蛙,非洲爪蟾,是研究SCI的优秀模式生物。它在蝌蚪阶段具有出色的再生能力,在蝌蚪阶段逐渐丧失,允许在再生和非再生阶段进行实验3,5。用于研究非洲爪蟾蝌蚪SCI的既定损伤方法包括尾部截肢,其中整个尾巴被移除,包括肌肉,赭骨和脊髓等组织6。这种方法有助于理解再生过程的一般机制4,7,8,9,10。
由于尾部截肢除脊髓外还涉及多个组织,这与人类SCI后发生的情况不同,因此SCI的研究需要更相关的损伤范式。我们依靠过去使用的研究11生成损伤范式的全面描述5,12,13,14和SCI12,13,14,15,16,17,18研究的不同方法.脊髓横切后,可以分离脊髓的尾部进行RNA和蛋白质表达以及高通量分析14,19,20,21。此外,在脊髓切除术之前或之后,药物和小分子的颅内注射以及cDNA,RNA或吗啉的电穿孔允许研究这些分子在预防或治疗SCI或SCI和脊髓再生后发生的特定事件中的作用13,14.此外,可以使用生化,分子,组织学和功能方法在损伤后的不同时间研究损伤进化和再生过程12,13,14,17,19,20,21,22,23。
最后,上述所有技术都可以用于非再生阶段,突出了使用 非洲爪蟾 作为模型生物研究SCI的最重要优势之一,即对同一物种的再生和非再生机制进行比较研究13,19,20,21,22。本文提出了 一种非洲爪蟾 蝌蚪脊髓横断的方案,从再生Nieuwkoop和Faber(NF)50期蝌蚪的分期和选择开始。接下来是描述脊髓手术产生假和截肢动物的程序,术后护理,最后通过测量游离蝌蚪游泳距离来分析功能恢复。
本文中描述的方案是执行 SCI 和评估功能恢复的极好方法。为了可重复性,必须种植健康的蝌蚪并选择大小相似的动物。缺乏适当的喂养会产生营养压力,导致再生能力差26;因此,应特别注意蝌蚪喂养。当蝌蚪在3-4周后达到50阶段时,它们可以在更高的温度下饲养以加速生长过程,18-25°C是最佳的27。水质很重要,因为动物对水条件和化学产品很敏感。最佳水条件包括使用碳过滤的无氯水,其参数如下:pH值(6.5-7.5),氯化物(<0.02 mg / L),水电导率(1.0 mS / cm ±0.1单位),铜(<0.3 mg / L);碳酸盐硬度(KH:5-10 dKH);一般硬度(生长激素:6-16分高);硝酸盐(NO3:<20毫克/升);和亚硝酸盐(NO2:<0.1毫克/升)14,27,28。此外,为避免污染,塑料罐应每周清洁一次,用于饲养动物,或在手术后每隔一天用无氯水和海绵彻底清洗;必须避免使用洗涤剂。
为了提高术后存活率,蝌蚪不得长时间(不超过2分钟)暴露于麻醉中。此外,建议一次麻醉一个蝌蚪。由于动物需要保持水分,因此在手术前后始终将动物浸泡在溶液中,并在开始手术前用勺子将溶液倒在蝌蚪的顶部。确保损伤范围足够广泛,可以覆盖整个脊髓,但不要太广泛,因为它会导致功能恢复不良或死亡。如果横截面受损,动物将被弯曲,功能恢复将受到影响。如果损伤超出尾部,死亡概率增加14。在游泳测定过程中,如果软件用蓝色阴影识别出每只动物,则记录被认为是正确的;否则,应重复录制。在录制过程中,重要的是要避免移动和空气或光线变化,以防止录制错误。
关于脊髓损伤和再生背后的细胞和分子机制,仍然存在许多悬而未决的问题。这项工作中描述的方案可用于研究不同细胞事件,基因表达和治疗对功能恢复的贡献,通过测量游泳能力来确定。此外,许多其他技术可以应用于手术动物。可以分离脊髓以进行蛋白质和/或mRNA提取14 ,以研究损伤和治疗后的蛋白质和基因表达谱19,20。该手术也是研究脊髓细胞反应22 和脊髓损伤后神经干祖细胞行为的基础12,13,22 。还使用本文描述的脊髓损伤范式研究了参与脊髓再生的信号级联反应23。总之,这里描述的方案是研究脊髓损伤和再生的极好模型,并已被用于许多有助于有关该主题的现有知识的研究。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由以下研究资助资助:PG Slater:FONDECYT N° 3190820;J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
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Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |