JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.

Abstract

Hücre dışı veziküller (EV’ ler) tüm hücre tipleri tarafından salınır ve hücre sinyalizasyonu ve homeostazda önemli bir rol oynar. EV’lerin görselleştirilmesi genellikle tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altında olan küçük çapları (40-250 nm) nedeniyle dolaylı yöntemler gerektirir. Kırınım sınırını hem iki hem de üç boyutta atlamak için EV’lerin süper çözünürlüklü mikroskopi tabanlı bir görselleştirmesini geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, EV’lerin üç boyutlu şeklini XY ekseninde +/- 20 nm çözünürlüğe ve Z ekseni boyunca +/- 50 nm çözünürlüğe çözebiliriz. Sonuç olarak, süper çözünürlüklü mikroskopinin, ekzozomlar ve zarflı virüsler de dahil olmak üzere EV’lerin bir karakterizasyon yöntemi olarak kabul edilmesini öneriyoruz.

Introduction

Hücre dışı veziklinler (EV’ ler) tüm hücre tipleri tarafından salınan membran bağlı veziküllerdir. Lipitler, proteinler, metabolitler ve nükleik asitler içerirler ve bu malzemeleri hücreler arasında lokal olarak ve dokular ve organlar arasında distal olarak aktarırlar. EV’lerin üç ana alt tipi vardır: apoptotik cisimler, mikrovesiküller ve ekzozomlar1,2. Burada, tartışmamızı eksozomlara ve ilişkili proteinlerine odaklıyoruz.

Ekzozomlar, erken endozomların çokvesiküler vücuda (MVB) içe doğru tomurcuklanmasından kaynaklanan veziküller salgılanır. MVB daha sonra plazma zarı ile kaynaşır ve eksozomları hücre dışı alana serbest bırakarak diğer hücrelere3,4. Ekzozomlar 40 ila 150 nm arasında değişen boyutlarda bulunur ve tetraspaninler (CD9, CD63, CD81), taşıma için gerekli olan membran bağlı endosomal sıralama kompleksi (ESCRT) ve lipid sal ile ilişkili proteinler 1,2 ,5,6,7olarak bilinen endosomal transmembran proteinleri ile zenginleştirilir.

Eksozomların biyokimyasal makyajını karakterize etmek, araştırmacıların işlevsel doğalarını daha iyi anlamaları için popüler bir alan haline gelmiştir. Nano ölçekli akış sitometrisi, nanopartikül izleme analizi (NTA), tarama ve iletim elektron mikroskopisi (TEM), yüzey plazmon rezonansı, dirençli darbe algılama ve her biri8,9eksileri içeren geleneksel ışık mikroskopisi dahil olmak üzere eksozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için birçok yöntem mevcuttur. TEM ve kriyo-EM nanometre tabanlı çözünürlük elde edebilir, ancak genellikle susuz bırakma ve donma-kırılma adımları gerektirir, böylece 10,11 EV’leriküçültür veya yutabilir. NTA, aynı anda yüzlerce EV’nin karakterizasyonuna izin vererek ışık saçılımlarına dayanır, ancak parçacık boyutunun dolaylı bir ölçümüdür ve EV’ler, virüsler ve protein agregaları arasında kolayca ayırt edemez12 , 13,14,15,16. Nano ölçekli akış sitometrisi, daha sonra boyut ölçümlerine çevrilebilen bir heyecan yolundan ışık saçılımını istihdam eder, ancak gelişmekte olan bir teknolojidir ve çeşitli aletler için doğrusal algılama aralığında parçacıkların boyutu hakkında çok az fikir birliği vardır12,17,18.

Floresan proteinler veya boyalar kullanılarak geleneksel ışık mikroskopisi, hücre altı bölmeleri, protein komplekslerini ve bir hücre içindeki sinyal makinelerini görselleştirmek için en yoğun kullanılan tekniklerden biri olmuştur. Bu teknik komplekslerin lokalizasyonunu görselleştirmede yararlı olsa da, geleneksel ışık mikroskopisinin kırınım sınırı (yaklaşık 250-400 nm), bir ekzozom (40-150 nm) 12,19,20‘nin tipik boyut aralığındaki proteinlerin veya yapıların net çözünürlüğünü önler.

Süper çözünürlüklü mikroskopi, yani doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), belirli floroforların fotowitchable özelliklerini kullanarak ve görüntüleri nanometre hassasiyeti21’ekadar yeniden oluşturmak için bu yanıp sönen olayları algılayarak geleneksel ışık mikroskopisinden kendini ayırır. Photoswitching olayları, on binlerce bireysel pozlama boyunca yüksek kare hızında algılama kamerası kullanılarak toplanır ve fotoğraf çekme floroforunun tam konumunu yüksek güvenle haritalamak için bir nokta yayma işlevi kullanılır19,20,22. Bu, dSTORM’un ışık mikroskopisinin kırınım sınırını atlamasına izin verir. Çeşitli gruplar, eksozomları ve ilişkili proteinleri22 , 23 , 24,25’igörselleştirmek ve izlemek için süper çözünürlüklü tekniklerin kullanıldığını bildirmektedir. Son çözünürlük floroforun biyofiziksel özelliklerine bağlıdır, ancak genellikle XY ekseni boyunca +/-10-100 nm arasında değişerek tek moleküllü çözünürlüğe izin verir.

XY ekseninde bu ölçekte bireysel floroforları çözme yeteneği mikroskopide devrim yaratmamıştır. Ancak, bir eksozom üç boyutlu (3-B) dSTORM hakkında çok az veri vardır. Bu nedenle, 3 boyutlu nanometre hassasiyetine ekozomlar da dahil olmak üzere saflaştırılmış EV’lerin dSTORM tabanlı görselleştirilmesi ve karakterizasyonu için standart bir işletim prosedürü (SÇP) oluşturmaya çalıştık.

Protocol

1 Hücre hatlarının yayılması ve bakımı İnsan osteosarkom hücreleri (U2OS) alıp hücreleri eksozom içermeyen Fetal Sığır Serumu ve 1x Penisilin/Streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş büyüme ortamına yerleştirin.NOT: McNamara et’te sunulan protokol sonrasında ekzozomsuz Fetal Sığır Serumu üretildi. al.26. U2OS hücrelerini % 5CO 2’de 37 °C’de bakır kaplı bir inkübatörde ve T175 şişelerinde geçiş hücrelerinde<sup class="xref"…

Representative Results

Bu çalışmanın amacı, nanometre çözünürlüğü olan bireysel EV’lerin üç boyutlu olarak (3-D) görselleştirilmesinde süper çözünürlüklü mikroskopinin etkinliğini değerlendirmektir. Bireysel EV’lerin şeklini ve boyutunu analiz etmek için, fotoğraflanabilir boya kullandık ve EV’leri uzak kırmızı, membran aralayıcı bir boya ile kuluçkaya yatırdık ve kromatografi29aracılığıyla fazla boyayı çıkardık. Benzeşim yakalanan anti-CD81 ve kırmızı lekeli EV’ler daha …

Discussion

EV’ler, birçok hücre içi işlemdeki önemli rolleri ve hücreden hücreye sinyalizasyon1,30. Bununla birlikte, küçük boyutları ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altına düştüğü için görselleştirmelerinin zor olduğu kanıtlanır. Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), zaman içinde bireysel floroforların fotoğraf çekme olaylarını yakalayarak ve bu yanıp sönen olaylara dayanarak bir görüntüyü yeni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Oxford Nanoimaging’e yapıcı geri bildirimleri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma 5UM1CA121947-10 tarafından R.P..M.’a ve 1R01DA040394’den D.P.D.’ye finanse edildi.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

Extracellular VesiclesDSTORMSuper-resolution MicroscopyThree-dimensional VisualizationVirus ParticlesDisease BiomarkersAffinity PurificationParaformaldehyde FixationImaging BufferCalibration Beads

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image