מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) משמשת לעקיפת מגבלת עקיפה אופיינית של מיקרוסקופיית אור ולהציג אקסוזומים בסולם הננומטר. זה יכול להיות מועסק בשניים ושלושה ממדים כדי לאפיין אקסוזומים.
שלל חוץ-תאי (EVs) משוחררים על ידי כל סוגי התאים וממלאים תפקיד חשוב באיתות התא ובהומאוסטזיס. ההדמיה של EVs דורשת לעתים קרובות שיטות עקיפות בשל הקוטר הקטן שלהם (40-250 ננומטר), שהוא מתחת לגבול העקיפה של מיקרוסקופיית אור טיפוסית. פיתחנו הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר של EVs כדי לעקוף את מגבלת עקיפה בשניים ושלושה ממדים. באמצעות גישה זו, אנו יכולים לפתור את הצורה התלת ממדית של EVs בתוך +/- 20 ננומטר רזולוציה על ציר XY ו + / – 50 ננומטר רזולוציה לאורך ציר Z. לסיכום, אנו מציעים כי מיקרוסקופיה ברזולוציית-על תיחשב כשיטת אפיון של EVs, כולל אקסוזומים, כמו גם וירוסים עטופים.
שלל חוץ-תאי (EVs) הם שלוקים הקשורים בממברנה המשתחררים על ידי כל סוגי התאים. הם מכילים שומנים, חלבונים, מטבוליטים וחומצות גרעין ומעבירים חומרים אלה באופן מקומי בין תאים ומעבירים בין רקמות ואיברים. ישנם שלושה תתי סוגים עיקריים של EVs: גופים אפופוטוטיים, microvesicles, ו exosomes1,2. כאן, אנו ממקדים את הדיון שלנו על אקסוזומים והחלבונים הקשורים שלהם.
אקסוזומים הם שלל מופרש שמקורו בהתפתחות הפנימית של אנדוזומים מוקדמים לתוך הגוף הרב-לשוני (MVB). לאחר מכן MVB מתמזג עם קרום הפלזמה, משחרר את exosomes לתוך החלל החוץ תאי לנסוע לתאים אחרים3,4. אקסוזומים קיימים על ספקטרום של גדלים הנעים בין 40 ל -150 ננומטר ומועשרים בחלבוני טרנס-מברן אנדוסומלית המכונים טטרספנינים (CD9, CD63, CD81), קומפלקס מיון אנדוסומאלי הקשור לממברנה הנדרש להובלה (ESCRT), וחלבונים הקשורים לרפסודה של שומנים1,2,5,6,7.
אפיון ההרכב הביוכימי של אקסוזומים הפך לתחום פופולרי עבור חוקרים להבין טוב יותר את האופי התפקודי שלהם. קיימות שיטות רבות להדמיה ואפיון אקסוזומים, כולל ציטומטריית זרימה ננומטרית, ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA), מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה ושידור (TEM), תהודה פלסמון פני השטח, חישת דופק התנגדותית ומיקרוסקופיה אור מסורתית, שכל אחד מהם מכיל יתרונות פנימיים וחסרונות8,9. TEM ו- cryo-EM יכולים להשיג רזולוציה מבוססת ננומטר, אך לעתים קרובות דורשים צעדי התייבשות ושבר בהקפאה, ובכך מתכווצים או מתרוממים EVs10,11. NTA מסתמכת על פיזור אור, המאפשר אפיון של מאות EVs בכל פעם, אבל היא מדידה עקיפה של גודל החלקיקים ולא יכול להבחין בקלות בין EVs, וירוסים, וחלבון אגרגטים12,13,14,15,16. ציטומטריית זרימה ננומטרית משתמשת בפיזור אור מנתיב עירור, אשר לאחר מכן ניתן לתרגם למדידות גודל, אבל היא טכנולוגיה מתפתחת, ויש קונצנזוס קטן על מה גודל החלקיקים נמצאים בטווח הליניארי של זיהוי עבור מכשירים שונים12,17,18.
מיקרוסקופיה אור מסורתית באמצעות חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים הייתה אחת הטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים תת-תאיים, מתחמי חלבון ומכונות איתות בתוך תא. בעוד טכניקה זו מוכיחה שימושית לדמיין את לוקליזציה של מתחמים, מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיה אור מסורתית (סביב 250-400 ננומטר) מונעת את הרזולוציה הברורה של חלבונים או מבנים בטווח הגודל הטיפוסי של exosome (40-150 ננומטר)12,19,20.
מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כלומר, מיקרוסקופיה שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM), מבדילה את עצמה ממיקרוסקופיה קלה קונבנציונלית על ידי שימוש בתכונות הניתנות לצילום של פלואורופורים ספציפיים וזיהוי אירועים מהבהבים אלה כדי לשחזר תמונות עד לדיוק ננומטר21. אירועים של פוטו-וויצ’ינג נאספים באמצעות מצלמת זיהוי בקצב גבוה במהלך עשרות אלפי חשיפות בודדות, ופונקציית התפשטות נקודה משמשת למיפוי בביטחון רב את המיקום המדויק של הפלורופור השוטף19,20,22. זה מאפשר dSTORM לעקוף את מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיית אור. מספר קבוצות דיווחו על שימוש בטכניקות ברזולוציית-על להדמיה ומעקב אחר אקסוזומים והחלבונים הקשורים22,23,24,25. הרזולוציה הסופית תלויה בתכונות הביופיסיות של הפלואורופור, אך לעתים קרובות נעה בין +/-10-100 ננומטר לאורך ציר ה-XY, ומאפשרת רזולוציה של מולקולה אחת.
היכולת לפתור פלואורופורים בודדים בקנה מידה זה על ציר XY חוללה מהפכה במיקרוסקופיה. עם זאת, יש מעט נתונים על dSTORM תלת מימדי (תלת-ממדי) של אקסוזום. לכן, ביקשנו לקבוע נוהל הפעלה סטנדרטי (SOP) להדמיה ואפיון מבוססי dSTORM של EVs מטוהרים, כולל אקסוזומים לדיוק ננומטר בתלת-ממד.
רכבים הסביבה הפכו לתחום מחקר פופולרי בשל תפקידם החשוב בתהליכים תאיים רבים ובאיתות מתא לתא1,30. עם זאת, ההדמיה שלהם מוכיחה להיות קשה כמו הגודל הקטן שלהם נופל מתחת לגבול עקיפה של מיקרוסקופיה אור. מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) היא שיטה ישירה להדמ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות ל-Oxford Nanoimaging על המשוב וההדרכה הבונים שלהם. עבודה זו מומנה על ידי 5UM1CA121947-10 ל R.P.M. ואת 1R01DA040394 ל D.P.D.D.
15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
RNase A | Promega | A797C | |
T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |