Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) используется для обхода типичного дифракционного предела световой микроскопии и для просмотра экзосом в нанометровом масштабе. Он может быть использован как в двух, так и в трех измерениях для характеристики экзосом.
Внеклеточные везикулы (EV) высвобождаются всеми типами клеток и играют важную роль в клеточной сигнализации и гомеостазе. Визуализация электромобилей часто требует косвенных методов из-за их малого диаметра (40-250 нм), который ниже дифракционного предела типичной световой микроскопии. Мы разработали визуализацию электромобилей на основе микроскопии сверхвысокого разрешения, чтобы обойти дифракционный предел как в двух, так и в трех измерениях. Используя этот подход, мы можем разрешить трехмерную форму электромобилей с разрешением +/- 20 нм по оси XY и разрешением +/- 50 нм по оси Z. В заключение мы предлагаем рассматривать микроскопию сверхвысокого разрешения как метод характеристики EV, включая экзосомы, а также вирусы в оболочке.
Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой мембранно-связанные везикулы, высвобождаемые всеми типами клеток. Они содержат липиды, белки, метаболиты и нуклеиновые кислоты и переносят эти материалы локально между клетками и дистально между тканями и органами. Существует три основных подтипа EV: апоптотические тела, микровезикулы и экзосомы1,2. Здесь мы сосредоточим наше обсуждение на экзосомах и связанных с ними белках.
Экзосомы представляют собой секретируемые везикулы, возникающие из внутреннего бутонизации ранних эндосом в мультивезикулярное тело (MVB). Затем MVB сливается с плазматической мембраной, высвобождая экзосомы во внеклеточное пространство для перемещения в другие клетки3,4. Экзосомы существуют в спектре размеров от 40 до 150 нм и обогащены эндосомальными трансмембранными белками, известными как тетраспанины (CD9, CD63, CD81), мембранно-связанным эндосомальным сортировочным комплексом, необходимым для транспорта (ESCRT), и липидными рафт-ассоциированными белками1,2,5,6,7.
Характеристика биохимического состава экзосом стала популярной областью для исследователей, чтобы лучше понять их функциональную природу. Существует множество методов визуализации и характеристики экзосом, включая наноразмерную проточную цитометрию, анализ отслеживания наночастиц (NTA), сканирующую и просвечивающую электронную микроскопию (TEM), поверхностный плазмонный резонанс, резистивное импульсное зондирование и традиционную световую микроскопию, каждая из которых содержит внутренние плюсы и минусы8,9. ТЭМ и крио-ЭМ могут достигать нанометрового разрешения, но часто требуют этапов обезвоживания и замораживания-разрушения, тем самым уменьшая или лизуя EV10,11. NTA полагается на рассеяние света, позволяя характеризовать сотни EV одновременно, но является косвенным измерением размера частиц и не может легко различить EV, вирусы и белковые агрегаты12,13,14,15,16. Наноразмерная проточная цитометрия использует рассеяние света от пути возбуждения, которое затем может быть преобразовано в измерения размера, но является новой технологией, и существует мало консенсуса относительно того, какой размер частиц находится в линейном диапазоне обнаружения для различных инструментов12,17,18.
Традиционная световая микроскопия с использованием флуоресцентных белков или красителей была одним из наиболее широко используемых методов визуализации субклеточных компартментов, белковых комплексов и сигнальных механизмов внутри клетки. Хотя этот метод оказывается полезным при визуализации локализации комплексов, дифракционный предел традиционной световой микроскопии (около 250-400 нм) препятствует четкому разрешению белков или структур в типичном диапазоне размеров экзосомы (40-150 нм)12,19,20.
Микроскопия сверхвысокого разрешения, а именно прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM), отличается от обычной световой микроскопии тем, что использует фотопереключаемые свойства конкретных флуорофоров и обнаруживает эти мигающие события для реконструкции изображений до нанометровой точности21. События переключения фотографий собираются с помощью камеры обнаружения с высокой частотой кадров в течение десятков тысяч индивидуальных экспозиций, а функция точечного распространения используется для отображения с высокой степенью достоверности точного местоположения фотопереключающего флуорофора19,20,22. Это позволяет dSTORM обходить дифракционный предел световой микроскопии. Несколько групп сообщили об использовании методов сверхвысокого разрешения для визуализации и отслеживания экзосом и связанных с ними белков22,23,24,25. Конечное разрешение зависит от биофизических свойств флуорофора, но часто колеблется от +/-10-100 нм вдоль оси XY, что позволяет использовать одномолекулярное разрешение.
Способность разрешать отдельные флуорофоры в этом масштабе на оси XY произвела революцию в микроскопии. Тем не менее, существует мало данных о трехмерном (3-D) dSTORM экзосомы. Поэтому мы стремились установить стандартную операционную процедуру (SOP) для визуализации и характеристики очищенных электромобилей на основе dSTORM, включая экзосомы с нанометровой точностью в 3D.
Электромобили стали популярной областью исследований из-за их важной роли во многих внутриклеточных процессах и межклеточной передаче сигналов1,30. Однако их визуализация оказывается сложной, поскольку их небольшой размер падает ниже дифракционного пр?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Oxford Nanoimaging за их конструктивную обратную связь и руководство. Эта работа финансировалась 5UM1CA121947-10 для R.P.M. и 1R01DA040394 для D.P.D.
15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
RNase A | Promega | A797C | |
T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |