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Biology

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。

Abstract

細胞外小胞(EV)は、細胞の種類を全て放出し、細胞シグナル伝達や恒常性に重要な役割を果たす。EV の視覚化には、通常の光顕微鏡の回折限界を超える小径 (40 ~250 nm) による間接的な方法が必要な場合が多い。我々は、2次元と3次元の両方で回折限界をバイパスするEVの超解像顕微鏡ベースの視覚化を開発しました。この方法を使用すると、XY 軸での解像度 +/- 20 nm 以内、Z 軸に沿った解像度 +/- 50 nm の解像度に、EV の 3 次元の形状を解決できます。結論として、我々は、超解像顕微鏡をエキソソームを含むEVの特性評価方法として、また、エンベロープウイルスとして考慮することを提案する。

Introduction

細胞外小胞(EV)は、全ての細胞タイプによって放出される膜結合小胞である。脂質、タンパク質、代謝産物、核酸を含み、細胞間で細胞間で局所的に、組織と器官の間で遠位に移動します。EV には、アポトーシス体、微小小胞、エキソソーム1、2という 3 つの主要なサブタイプがあります。ここでは、エキソソームとその関連タンパク質に焦点を当てます。

エキソソームは、初期の子宮体の内出から多胸体(MVB)に由来する小胞を分泌する。MVBは、その後、細胞膜と融合し、エキソソームを細胞外空間に放出して、他の細胞3、4に移動する。エキソソームは40~150nmの範囲の大きさのスペクトルに存在し、テトラスパニン(CD9、CD63、CD81)、輸送に必要な膜結合性内膜選別複合体(ESCRT)、および脂質いかだ関連タンパク質1、2、5、6、7と呼ばれる内皮貫膜タンパク質で富化される。

エキソソームの生化学的構成を特徴付け、研究者が機能性をよりよく理解する人気の分野となっています。ナノスケールフローサイトメトリー、ナノ粒子追跡解析(NTA)、走査・透過電子顕微鏡(TEM)、表面プラズモン共鳴、抵抗パルスセンシング、従来の光顕微鏡など、エキソソームの視覚化と特徴付けには多くの方法があり、それぞれに本質的な長所と短所8,9が含まれています。TEMとcryo-EMはナノメートルベースの分解を達成することができるが、しばしば脱水および凍結破壊ステップを必要とし、それによってEV10、11を収縮またはライシングする。NTAは光散乱に依存し、一度に数百個のEVの特性を持たせることができますが、粒子サイズの間接的な測定であり、EV、ウイルス、およびタンパク質凝集体12、13、14、15、16を容易に区別することはできません。ナノスケールフローサイトメトリーは励起路からの光散乱を採用し、その後サイズ測定に変換することができるが、新たな技術であり、様々な機器12、17、18の検出の線形範囲内にある粒子のサイズについてはほとんどコンセンサスがない。

蛍光タンパク質や色素を用いた従来の光顕微鏡は、細胞内の細胞内コンパートメント、タンパク質複合体、およびシグナル伝達機械を可視化するために最も採用されている技術の1つであった。この技術は、複合体の局在化を可視化するのに有用であることが証明されるが、従来の光顕微鏡(250〜400nm前後)の回折限界は、エキソソーム(40-150 nm)12、19、20の典型的なサイズ範囲におけるタンパク質または構造の明確な分解能を防ぐ。

超解像顕微鏡、すなわち直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、特定の蛍光ホルの光スイッチ可能な特性を採用し、これらの点滅事象を検出してナノメートル精度21まで画像を再構築することによって、従来の光顕微鏡と区別する。光スイッチングイベントは、数万個の個別露光の過程で高フレームレート検出カメラを用いて収集され、ポイントスプレッド関数は、光スイッチング蛍光体19、20、22の正確な位置を高い信頼度でマッピングするために使用される。これにより、dSTORMは光顕微鏡の回折限界をバイパスすることができます。いくつかのグループは、エキソソームおよび関連するタンパク質22、23、24、25を視覚化および追跡するための超解像技術の使用を報告している。最終的な分解能は、フルオロフォアの生物物理学的性質に依存しますが、多くの場合、XY軸に沿って+/-10-100nmの範囲であり、単一分子分解能を可能にします。

XY軸でこのスケールで個々の蛍光体を解決する能力は、顕微鏡に革命を起こしました。しかし、エキソソームの3次元(3次元)dSTORMに関するデータはほとんどありません。そこで、3次元のエキソソームからナノメートルの精度を含む、精製EVのdSTORMベースの可視化と特性評価のための標準的な操作手順(SOP)を確立することを求めました。

Protocol

1 細胞株の伝播と維持 ヒト骨肉腫細胞(U2OS)を取得し、10%エキソソームフリーウシ胎児血清および1xペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加した成長培地に細胞を入れる。注:エキソソームフリーの胎児ウシ血清は、マクナマラで提示されたプロトコルに従って生成されました。al.26. U2OS細胞を銅被覆インキュベーターの37°Cで5%CO2、T175フラスコ<sup c…

Representative Results

本研究の目的は、3次元(3次元)のナノメートル分解能を有する個々のEVを可視化する上での超解像顕微鏡の有効性を評価することであった。個々のEVの形状と大きさを解析するために、光切り替え可能な色素を採用し、遠赤色の膜インターカラット色素でEVをインキュベートし、クロマトグラフィー29を介して過剰な色素を除去した。アフィニティキャプチャー抗CD81および赤色…

Discussion

EVは、多くの細胞内プロセスおよび細胞間シグナル伝達1,30において重要な役割を果たしているため、研究分野として人気となっている。しかし、その小さなサイズが光顕微鏡の回折限界を下回るので、その視覚化は困難であることが判明した。直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、個々の蛍光体の光スイッチングイベントを経時に捉え、これらの…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

オックスフォード・ナノイメージングの建設的なフィードバックと指導に感謝します。この作業は、5UM1CA121947-10からR.P.Mに、1R01DA040394からD.P.D.に資金提供されました。

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
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References

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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
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