يستخدم المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) لتجاوز حد الحيود النموذجي للتنظير المجهري للضوء وعرض الاكسوسومات على مقياس النانومتر. ويمكن استخدامه في كل من البعدين وثلاثة لتوصيف exosomes.
يتم تحرير الحويصلات خارج الخلية (EVs) من قبل جميع أنواع الخلايا وتلعب دورا هاما في إشارات الخلايا و التوازن. غالبا ما يتطلب تصور المركبات الكهربائية طرقا غير مباشرة بسبب قطرها الصغير (40-250 نانومتر) ، والذي هو تحت حد الحيود للتنظير الضوئي النموذجي. لقد طورنا تصورا فائق الدقة قائم على المجهر للمركبات الكهربائية لتجاوز حد الحيود في بعدين وثلاثة أبعاد على حد سواء. باستخدام هذا النهج، يمكننا حل شكل ثلاثي الأبعاد من المركبات الكهربائية إلى داخل +/- 20 نانومتر القرار على محور س ص و +/- 50 نانومتر القرار على طول المحور Z. في الختام، نقترح أن يعتبر الفحص المجهري فائق الدقة كطريقة توصيف للمركبات الكهربائية، بما في ذلك الإكسوسومات، وكذلك الفيروسات المغلفة.
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات المرتبطة بالغشاء الصادرة عن جميع أنواع الخلايا. أنها تحتوي على الدهون والبروتينات والأيض والأحماض النووية ونقل هذه المواد محليا بين الخلايا وdistally بين الأنسجة والأعضاء. هناك ثلاثة أنواع فرعية أساسية من المركبات الكهربائية: الهيئات المبرمج، microvesicles، وإكسوسومات1،2. هنا، نركز مناقشتنا على الإكسوسومات والبروتينات المرتبطة بها.
يتم إفراز الحويصلات الخارجية الناشئة من الداخل الناشئة من الاندوسومات المبكرة في الجسم متعدد المركبات (MVB). ثم يندمج MVB مع غشاء البلازما ، ويطلق الإكسوسومات في الفضاء خارج الخلية للسفر إلى خلايا أخرى3،4. Exosomes موجودة على مجموعة من الأحجام تتراوح بين 40 إلى 150 نانومتر ويتم إثراء مع بروتينات ترانسممبران الاندوسومال المعروفة باسم tetraspanins (CD9، CD63، CD81)، مجمع الفرز الاندوسومالية المرتبطة بالغشاء المطلوبة للنقل (ESCRT)، والبروتينات المرتبطة طوف الدهون1،2،5،6،7.
أصبح توصيف التركيبة الكيميائية الحيوية للإكسوسومات مجالا شائعا للباحثين لفهم طبيعتهم الوظيفية بشكل أفضل. توجد العديد من الطرق لتصور وتميز exosomes ، بما في ذلك قياس التدفق النانوي ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، والمسح الضوئي ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) ، وصدى البلازمون السطحي ، واستشعار النبض المقاوم ، والمجهر الخفيف التقليدي ، كل منها يحتوي على إيجابيات وسلبيات جوهرية8،9. TEM و cryo-EM يمكن تحقيق القرار القائم على نانومتر، ولكن غالبا ما تتطلب الجفاف وتجميد كسر الخطوات، وبالتالي تقليص أو lysing المركبات الكهربائية10،11. يعتمد NTA على تشتت الضوء ، مما يسمح بتحديد خصائص مئات المركبات الكهربائية في وقت واحد ، ولكنه قياس غير مباشر لحجم الجسيمات ولا يمكنه التمييز بسهولة بين المركبات الكهربائية والفيروساتومجاميع البروتين12و13و14و15و16. يستخدم قياس التدفق الخلوي النانوي الضوء المتناثر من مسار الإثارة ، والذي يمكن ترجمته بعد ذلك إلى قياسات الحجم ، ولكنه تقنية ناشئة ، وهناك القليل من الإجماع حول حجم الجسيمات ضمن النطاق الخطي للكشف عن الأدوات المختلفة12و17و18.
كان المجهر الخفيف التقليدي باستخدام البروتينات الفلورية أو الأصباغ أحد التقنيات الأكثر توظيفا لتصور المقصورات دون الخلوية ومجمعات البروتين وآلات الإشارات داخل الخلية. في حين أن هذه التقنية تثبت فائدتها في تصور توطين المجمعات ، فإن حد الحيود للتنظير المجهري الخفيف التقليدي (حوالي 250-400 نانومتر) يمنع الدقة الواضحة للبروتينات أو الهياكل في نطاق الحجم النموذجي للإكسوسوم (40-150 نانومتر)12،19،20.
المجهر فائق الدقة ، وهي المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) ، يميز نفسه عن المجهر الضوئي التقليدي من خلال توظيف الخصائص القابلة للضوء للفلوروفوريس المحددة والكشف عن هذه الأحداث الوامضة لإعادة بناء الصور وصولا إلى الدقة نانومتر21. يتم جمع أحداث Photoswitching باستخدام كاميرا كشف عالية الإطار على مدار عشرات الآلاف من التعرض الفردي ، ويتم استخدام وظيفة انتشار نقطة لرسم خريطة بثقة عالية الموقع الدقيق للفلوروفور الساحرللضوء 19،20،22. وهذا يسمح dSTORM لتجاوز الحد الحيود من المجهر الخفيفة. وأفادت عدة مجموعات استخدام تقنيات فائقة الدقة لتصور وتتبع exosomes والبروتينات المرتبطة بها22،23،24،25. يعتمد القرار النهائي على الخصائص الفيزيائية الحيوية للفلوروفور ، ولكنه يتراوح في كثير من الأحيان من +/-10-100 نانومتر على طول محور XY ، مما يسمح بدقة جزيء واحد.
القدرة على حل الفلوروفوريس الفردية على هذا النطاق على محور XY قد أحدثت ثورة في المجهر. ومع ذلك ، هناك القليل من البيانات عن ثلاثي الأبعاد (3 – D) dSTORM من exosome. لذلك ، سعينا إلى إنشاء إجراء تشغيل قياسي (SOP) للتصور القائم على dSTORM وتوصيف المركبات الكهربائية النقية ، بما في ذلك exosomes إلى الدقة نانومتر في 3-D.
أصبحت المركبات الكهربائية مجال الدراسة شعبية نظرا لدورها الهام في العديد من العمليات داخل الخلايا والخلايا إلى الخلية الإشارات1،30. ومع ذلك ، فإن تصورها يثبت أن يكون صعبا كما حجمها الصغير يقع تحت الحد الحيود من المجهر الخفيفة. المباشرة الاستوشاستيك البصرية…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر أكسفورد Nanoimaging على ردود فعلهم البناءة والتوجيه. تم تمويل هذا العمل من قبل 5UM1CA121947-10 إلى R.P.M و1R01DA040394 إلى D.P.D.
15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
RNase A | Promega | A797C | |
T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |