A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é usada para contornar o limite típico de difração de microscopia leve e para visualizar exosóis na escala de nanômetros. Pode ser empregado em duas e três dimensões para caracterizar exossomos.
Vesículos extracelulares (EVs) são liberados por todos os tipos de células e desempenham um papel importante na sinalização celular e homeostase. A visualização de EVs muitas vezes requer métodos indiretos devido ao seu pequeno diâmetro (40-250 nm), que está abaixo do limite de difração da microscopia de luz típica. Desenvolvemos uma visualização de EVs baseada em microscopia de super resolução para contornar o limite de difração em duas e três dimensões. Usando esta abordagem, podemos resolver a forma tridimensional dos EVs para dentro de resolução de +/- 20 nm no eixo XY e resolução de +/- 50 nm ao longo do eixo Z. Em conclusão, propomos que a microscopia de super resolução seja considerada como um método de caracterização de EVs, incluindo exosósmos, bem como vírus envoltos.
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas ligadas à membrana liberadas por todos os tipos de células. Eles contêm lipídios, proteínas, metabólitos e ácidos nucleicos e transferem esses materiais localmente entre as células e distally entre tecidos e órgãos. Existem três subtipos primários de EVs: corpos apoptóticos, microvesículos e exosóis1,2. Aqui, focamos nossa discussão sobre exossomos e suas proteínas associadas.
Exosóis são vesículas secretadas originárias do brotamento interno de endosários primitivos no corpo multivesicular (MVB). O MVB então se funde com a membrana plasmática, liberando os exossomos no espaço extracelular para viajar para outras células3,4. Os exosóis existem em um espectro de tamanhos que variam de 40 a 150 nm e são enriquecidos com proteínas transmembranas endossomais conhecidas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), complexo de triagem endosômico ligado à membrana necessário para o transporte (ESCRT), e proteínas lipídicas associadas à balsa1,2,5,6,7.
Caracterizar a composição bioquímica dos exossomos tornou-se um campo popular para os pesquisadores entenderem melhor sua natureza funcional. Existem muitos métodos para visualizar e caracterizar exossomos, incluindo citometria de fluxo nanoescala, análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia eletrônica de varredura e transmissão (TEM), ressonância de plasmon superficial, sensoriamento de pulso resistivo e microscopia de luz tradicional, cada uma das quais contém prós intrínsecos e contras8,9. TEM e crio-EM podem alcançar resolução baseada em nanômetros, mas muitas vezes requerem etapas de desidratação e fratura congelante, diminuindo ou reduzindo os EVs10,11. O NTA conta com a dispersão de luz, permitindo a caracterização de centenas de EVs de cada vez, mas é uma medição indireta do tamanho das partículas e não pode distinguir facilmente entre EVs, vírus e agregados proteicos12,13,14,15,16. A citometria de fluxo nanoescala emprega a dispersão de luz a partir de um caminho de excitação, que pode então ser traduzido em medidas de tamanho, mas é uma tecnologia emergente, e há pouco consenso sobre o tamanho das partículas dentro da faixa linear de detecção para vários instrumentos12,17,18.
A microscopia leve tradicional usando proteínas fluorescentes ou corantes tem sido uma das técnicas mais utilizadas para visualizar compartimentos subcelulares, complexos proteicos e máquinas de sinalização dentro de uma célula. Embora essa técnica se mostre útil na visualização da localização de complexos, o limite de difração da microscopia de luz tradicional (em torno de 250-400 nm) impede a clara resolução de proteínas ou estruturas na faixa de tamanho típico de um exososomo (40-150 nm)12,19,20.
A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM), distingue-se da microscopia de luz convencional, empregando as propriedades fotosssuráveis de fluoroforos específicos e detectando esses eventos piscando para reconstruir imagens até a precisão de nanômetros21. Eventos de captura de fotos são coletados usando uma câmera de detecção de alta moldura ao longo de dezenas de milhares de exposições individuais, e uma função de propagação de pontos é usada para mapear com alta confiança a localização exata do fluoróforo de fotossar19,20,22. Isso permite que o dSTORM contorne o limite de difração da microscopia leve. Vários grupos relataram o uso de técnicas de super-resolução para visualização e rastreamento de exossomos e suas proteínas associadas22,23,24,25. A resolução final depende das propriedades biofísicas do fluoróforo, mas muitas vezes varia de +/-10-100 nm ao longo do eixo XY, permitindo a resolução de molécula única.
A capacidade de resolver fluoroforos individuais nesta escala no eixo XY revolucionou a microscopia. No entanto, há poucos dados sobre o dSTORM tridimensional (3-D) de um exossomo. Por isso, buscamos estabelecer um procedimento operacional padrão (SOP) para visualização e caracterização baseada em dSTORM de EVs purificados, incluindo exosóis à precisão de nanômetros em 3D.
Os EVs tornaram-se uma área de estudo popular devido ao seu importante papel em muitos processos intracelulares e sinalização celular-celular1,30. No entanto, sua visualização se mostra difícil, pois seu pequeno tamanho fica abaixo do limite de difração da microscopia leve. A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é um método direto de visualização que contorna o limite de difração capturando eventos de fotofraco de fluor…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Oxford Nanoimaging por seu feedback e orientação construtivas. Este trabalho foi financiado pelo 5UM1CA121947-10 para R.P.M. e o 1R01DA040394 para D.P.D.
15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
RNase A | Promega | A797C | |
T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |