In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Summary

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

Abstract

La muerte celular inmunogénica de los tumores, causada por la quimioterapia o la irradiación, puede desencadenar respuestas de células T específicas del tumor al liberar patrones moleculares asociados al peligro e inducir la producción de interferón tipo I. Las inmunoterapias, incluida la inhibición del punto de control, se basan principalmente en células T preexistentes específicas del tumor para desplegar un efecto terapéutico. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos sinérgicos que explotan la muerte celular inmunogénica como una vacuna intrínseca contra el cáncer pueden mejorar su capacidad de respuesta. Sin embargo, el espectro de factores inmunogénicos liberados por las células bajo estrés inducido por la terapia sigue estando incompletamente caracterizado, especialmente con respecto a las vesículas extracelulares (EV). Se considera que los EV, partículas membranosas a nanoescala emitidas por prácticamente todas las células, facilitan la comunicación intercelular y, en el cáncer, se ha demostrado que median el cebado cruzado contra los antígenos tumorales. Para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores en diversas condiciones, se buscan métodos adaptables, escalables y válidos. Por lo tanto, aquí se presenta un enfoque relativamente fácil y robusto para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los EV. El protocolo se basa en el análisis de citometría de flujo de células T esplénicas después de la inmunización in vivo de ratones con EV, aislados por ensayos basados en precipitaciones de cultivos de células tumorales en condiciones de terapia o estado estacionario. Por ejemplo, este trabajo muestra que la exposición al oxaliplatino de las células de melanoma murino B16-OVA resultó en la liberación de EV inmunogénicos que pueden mediar la activación de las células T citotóxicas reactivas al tumor. Por lo tanto, la detección de EV a través de la inmunización in vivo y la citometría de flujo identifica las condiciones bajo las cuales pueden surgir EV inmunogénicos. La identificación de las condiciones de liberación de EV inmunogénicos proporciona un requisito previo esencial para probar la eficacia terapéutica de los EV contra el cáncer y explorar los mecanismos moleculares subyacentes para finalmente revelar nuevos conocimientos sobre el papel de los EV en la inmunología del cáncer.

Introduction

El sistema inmunitario desempeña un papel fundamental en la lucha contra el cáncer, tanto cuando es incitado por la inhibición del punto de control inmunitario como por la eficacia de las terapias convencionales contra el cáncer. Las células tumorales que sucumben a terapias genotóxicas como los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino y doxorrubicina, o el tratamiento con radiación ionizante pueden liberar antígenos y patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) que potencialmente inician una respuesta inmune antitumoral ^adaptativa1. Las DAMP más destacadas, en el contexto de la muerte celular inmunogénica, incluyen señales find-me como atp quimiotáctico, señales eat-me como la exposición a calreticulina, que promueve la absorción de células tumorales por las células presentadoras de antígenos, y la liberación de HMGB1, que activa los receptores de reconocimiento de patrones, mejorando así la presentación cruzada de antígenos ^tumorales2. Además, los interferones de tipo I (IFN-I), inducidos a través de ácidos nucleicos inmunogénicos derivados de tumores u otros estímulos, son detectados por las células dendríticas, lo que les permite cebar eficazmente las células T citotóxicas específicas del ^tumor3,4. Clínicamente, las células T CD8⁺ activadas y en proliferación que se infiltran en el tumor proporcionan un factor pronóstico independiente para la supervivencia prolongada en muchos pacientes con cáncer. Liberado de tales células T activadas, el IFN-γ media efectos antiproliferativos directos sobre las células cancerosas e impulsa la polarización Th1 y la diferenciación citotóxica de las células T, contribuyendo así a una inmunovigilancia efectiva contra el ^cáncer5,6. El oxaliplatino es un inductor de muerte celular inmunogénico de buena fe, que media dicha respuesta inmune adaptativa contra el ^cáncer7. Sin embargo, la plétora de señales inmunogénicas iniciales liberadas por las células tumorales bajo estrés inducido por la terapia aún no se ha revelado por completo. A pesar de los avances significativos en la inmunoterapia contra el cáncer, la expansión de sus beneficios a una mayor parte de los pacientes sigue siendo un desafío. Una comprensión más detallada de las señales inmunogénicas que inician la activación de las células T puede guiar el desarrollo de nuevas terapias.

Un grupo heterogéneo de estructuras cerradas por membrana, conocidas como vesículas extracelulares (EV), parecen servir como dispositivos de comunicación intercelular. Emitidos por prácticamente todos los tipos de células, los EV transportan proteínas funcionales, ARN, ADN y otras moléculas a una célula receptora o pueden alterar el estado funcional de una célula simplemente uniéndose a los receptores en la superficie celular. Su carga biológicamente activa varía significativamente según el tipo y el estado funcional de la célula ^generadora8. En inmunología del cáncer, los EV liberados de las células tumorales se han considerado predominantemente como adversarios de la inmunoterapia porque eventualmente promueven el crecimiento invasivo, preforman nichos metastásicos9 y suprimen la respuesta ^inmune10. Por el contrario, algunos estudios han demostrado que los EV pueden transferir antígenos tumorales a las células dendríticas para una presentación cruzada ^{efectiva11,12}. Los EV pueden proporcionar ácidos nucleicos inmunoestimulantes si emergen bajo estrés inducido por la terapia, lo que facilita una respuesta inmune ^{antitumoral13,14}. Recientemente se ha demostrado que la detección de dichos ligandos inmunes innatos de ARN y ADN en el microambiente tumoral modula significativamente la capacidad de respuesta al bloqueo del punto de control15,16,17. Por lo tanto, el papel inmunogénico de los EV liberados por las células tumorales bajo diferente estrés inducido por la terapia debe dilucidarse aún más. Dado que los vehículos eléctricos constituyen un campo de investigación joven pero en crecimiento, la estandarización de los métodos aún está en curso. Por lo tanto, compartir conocimientos es esencial para mejorar la reproducibilidad de la investigación sobre las interacciones entre los EV y la inmunología del cáncer. Con esto en mente, este manuscrito describe un protocolo simple para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores in vivo.

Esta evaluación se realiza mediante la generación de EV derivados de tumores, inmunizando a los ratones receptores con esos EV y analizando las células T esplénicas a través de la citometría de flujo. La generación de EV se realiza idealmente mediante la siembra de células tumorales murinas en un medio de cultivo celular libre de EV para un alto grado de pureza. Las células se tratan con un estímulo de estrés celular específico, como la quimioterapia, para comparar el efecto de los EV inducidos por la terapia con la inmunogenicidad basal de los respectivos EV derivados del tumor. El aislamiento de los EV bien puede realizarse mediante diversas técnicas que deben seleccionarse de acuerdo con la aplicabilidad in vivo y la disponibilidad local. El siguiente protocolo describe un ensayo basado en la precipitación con un kit comercial para la purificación de ev. Los ratones son inmunizados dos veces con esos VEHÍCULOS ELÉCTRICOS. Catorce días después de la primera inyección, las células T se extraen del bazo y se analizan para la producción de IFN-γ a través de la citometría de flujo para evaluar una respuesta inmune sistémica. Con esto, el potencial de los EV derivados de tumores, surgidos bajo diferentes regímenes terapéuticos, para inducir respuestas antitumorales de células T se evalúa con relativa facilidad, rapidez y alta ^validez13. Por lo tanto, este método es adecuado para una detección inmunológica de EV derivados de células cancerosas en diversas condiciones.

Protocol

Al inicio de los experimentos, los ratones tenían al menos 6 semanas de edad y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. El presente protocolo cumple con los estándares éticos institucionales y las regulaciones locales vigentes. Los estudios en animales fueron aprobados por la agencia reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los posibles sesgos relacionados con el sexo no se investigaron en estos estudios. 1. Generación y aislamiento de EV derivad…

Representative Results

Este protocolo está destinado a facilitar la evaluación directa y fácilmente reproducible de la inmunogenicidad de los EV derivados de tumores. De este modo, los ratones son inoculados con EV derivados de cultivos in vitro de células tumorales que expresan el antígeno modelo de ovoalbúmina de pollo (OVA). La respuesta inmune posterior se analiza en células T esplénicas a través de citometría de flujo. La Figura 1 ofrece una visión gene…

Discussion

Este protocolo proporciona una evaluación inmunológica in vivo de los EV derivados de células de melanoma bajo estrés inducido por la quimioterapia mientras se adapta a los EV emitidos por varios cánceres bajo diversos tratamientos. La inmunización de ratones con EV derivados de células B16-OVA tratadas con oxaliplatino, por ejemplo, expande las células T CD8 ⁺ productoras de IFN-γ en el bazo, que se estimulan aún más mediante la incubación ex vivo con ovoalbúmina, lo que indica …

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)