In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Summary

Questo manoscritto descrive come valutare l’immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dalle cellule tumorali (EV) utilizzando la citometria a flusso. Gli EV derivati da tumori sottoposti a morte cellulare immunogenica indotta dal trattamento sembrano particolarmente rilevanti nell’immunosorveglianza tumorale. Questo protocollo esemplifica la valutazione dei veicoli elettrici immunostimolatori del tumore indotti da oxaliplatino, ma può essere adattato a varie impostazioni.

Abstract

La morte cellulare immunogenica dei tumori, causata dalla chemioterapia o dall’irradiazione, può innescare risposte delle cellule T specifiche del tumore rilasciando modelli molecolari associati al pericolo e inducendo la produzione di interferone di tipo I. Le immunoterapie, compresa l’inibizione del checkpoint, si basano principalmente su cellule T tumorali specifiche preesistenti per dispiegare un effetto terapeutico. Pertanto, approcci terapeutici sinergici che sfruttano la morte cellulare immunogenica come vaccino anti-cancro intrinseco possono migliorare la loro reattività. Tuttavia, lo spettro dei fattori immunogenici rilasciati dalle cellule sotto stress indotto dalla terapia rimane incompletamente caratterizzato, specialmente per quanto riguarda le vescicole extracellulari (EV). Gli EV, particelle membranose su scala nanometrica emesse praticamente da tutte le cellule, sono considerati per facilitare la comunicazione intercellulare e, nel cancro, hanno dimostrato di mediare il cross-priming contro gli antigeni tumorali. Per valutare l’effetto immunogenico dei veicoli elettrici derivati da tumori in varie condizioni, sono ricercati metodi adattabili, scalabili e validi. Pertanto, qui viene presentato un approccio relativamente semplice e robusto per valutare l’immunogenicità in vivo dei veicoli elettrici. Il protocollo si basa sull’analisi citometrica a flusso di cellule T spleniche dopo immunizzazione in vivo di topi con EV, isolati da saggi basati sulla precipitazione da colture di cellule tumorali in terapia o condizioni di stato stazionario. Ad esempio, questo lavoro mostra che l’esposizione all’oxaliplatino delle cellule di melanoma murino B16-OVA ha provocato il rilascio di EV immunogenici che possono mediare l’attivazione delle cellule T citotossiche reattive al tumore. Quindi, lo screening dei veicoli elettrici tramite immunizzazione in vivo e citometria a flusso identifica le condizioni in cui i veicoli elettrici immunogenici possono emergere. L’identificazione delle condizioni di rilascio di EV immunogenici fornisce un prerequisito essenziale per testare l’efficacia terapeutica dei veicoli elettrici contro il cancro ed esplorare i meccanismi molecolari sottostanti per svelare in definitiva nuove intuizioni sul ruolo dei veicoli elettrici nell’immunologia del cancro.

Introduction

Il sistema immunitario svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro il cancro, sia quando incitato dall’inibizione del checkpoint immunitario sia per l’efficacia delle terapie convenzionali contro il cancro. Le cellule tumorali che soccombono a terapie genotossiche come gli agenti chemioterapici oxaliplatino e doxorubicina o il trattamento con radiazioni ionizzanti possono rilasciare antigeni e modelli molecolari associati al pericolo (DMP) che potenzialmente avviano una risposta immunitaria antitumorale ^adattativa1. I DAMP più importanti, nel contesto della morte cellulare immunogenica, includono segnali find-me come ATP chemiotattico, segnali eat-me come l’esposizione di calreticulina, che promuove l’assorbimento delle cellule tumorali da parte delle cellule che presentano l’antigene, e il rilascio di HMGB1, che attiva i recettori di riconoscimento del pattern, migliorando così la presentazione incrociata degli antigeni ^tumorali2. Inoltre, gli interferoni di tipo I (IFN-I), indotti tramite acidi nucleici immunogenici derivati dal tumore o altri stimoli, sono rilevati dalle cellule dendritiche, consentendo loro di innescare efficacemente cellule T citotossiche specifiche del ^tumore3,4. Clinicamente, le cellule T CD8⁺ attivate e proliferanti che si infiltrano nel tumore forniscono un fattore prognostico indipendente per una sopravvivenza prolungata in molti pazienti oncologici. Rilasciato da tali cellule T attivate, l’IFN-γ media effetti antiproliferativi diretti sulle cellule tumorali e guida la polarizzazione Th1 e la differenziazione citotossica delle cellule T, contribuendo così a un’efficace immunosorveglianza contro il ^cancro5,6. L’oxaliplatino è un induttore di morte cellulare immunogenico in buona fede, che media tale risposta immunitaria adattativa contro il ^cancro7. Tuttavia, la pletora di segnali immunogenici iniziali rilasciati dalle cellule tumorali sotto stress indotto dalla terapia rimane da svelare completamente. Nonostante i significativi progressi nell’immunoterapia del cancro, espandere i suoi benefici a una porzione più ampia di pazienti rimane una sfida. Una comprensione più dettagliata dei segnali immunogenici che avviano l’attivazione delle cellule T può guidare lo sviluppo di nuove terapie.

Un gruppo eterogeneo di strutture racchiuse in membrana, note come vescicole extracellulari (EV), sembrano servire come dispositivi di comunicazione intercellulare. Emessi praticamente da tutti i tipi di cellule, gli EV trasportano proteine funzionali, RNA, DNA e altre molecole a una cellula ricevente o possono alterare lo stato funzionale di una cellula semplicemente legandosi ai recettori sulla superficie cellulare. Il loro carico biologicamente attivo varia significativamente in base al tipo e allo stato funzionale della cellula ^generatrice8. Nell’immunologia del cancro, i veicoli elettrici rilasciati dalle cellule tumorali sono stati prevalentemente considerati come avversari dell’immunoterapia perché alla fine promuovono la crescita invasiva, preformano nicchie metastatiche9 e sopprimono la risposta ^{immunitaria10}. Al contrario, alcuni studi hanno dimostrato che gli EV possono trasferire antigeni tumorali alle cellule dendritiche per un’efficace presentazione ^{incrociata11,12}. I veicoli elettrici possono fornire acidi nucleici immunostimolatori se emergono sotto stress indotto dalla terapia, facilitando una risposta immunitaria antitumorale13,14. Il rilevamento di tali ligandi immunitari innati di RNA e DNA nel microambiente tumorale ha recentemente dimostrato di modulare significativamente la reattività al blocco del checkpoint15,16,17. Quindi, il ruolo immunogenico degli EV rilasciati dalle cellule tumorali sotto diverso stress indotto dalla terapia deve essere ulteriormente chiarito. Poiché i veicoli elettrici costituiscono un campo di ricerca giovane ma in crescita, la standardizzazione dei metodi è ancora in corso. Pertanto, la condivisione delle conoscenze è essenziale per migliorare la riproducibilità della ricerca sulle interazioni tra veicoli elettrici e immunologia del cancro. Con questo in mente, questo manoscritto descrive un semplice protocollo per valutare l’effetto immunogenico dei veicoli elettrici derivati dal tumore in vivo.

Questa valutazione viene eseguita generando EV derivati dal tumore, immunizzando i topi riceventi con quei veicoli elettrici e analizzando le cellule T spleniche tramite citometria a flusso. La generazione di veicoli elettrici viene eseguita idealmente seminando cellule tumorali murine in un terreno di coltura cellulare privo di EV per un alto grado di purezza. Le cellule vengono trattate con uno specifico stimolo di stress cellulare, come la chemioterapia, per confrontare l’effetto dei veicoli elettrici indotti dalla terapia con l’immunogenicità basale dei rispettivi VEICOLI elettrici derivati dal tumore. L’isolamento dei veicoli elettrici può essere eseguito con varie tecniche che dovrebbero essere selezionate in base all’applicabilità in vivo e alla disponibilità locale. Il seguente protocollo descrive un test basato sulla precipitazione con un kit commerciale per la purificazione dei veicoli elettrici. I topi sono immunizzati due volte con quei veicoli elettrici. Quattordici giorni dopo la prima iniezione, le cellule T vengono estratte dalla milza e analizzate per la produzione di IFN-γ tramite citometria a flusso per valutare una risposta immunitaria sistemica. Con questo, il potenziale degli EV derivati dal tumore, che emergono sotto diversi regimi terapeutici, per indurre risposte antitumorali delle cellule T viene valutato in modo relativamente semplice, rapido e con elevata ^validità13. Pertanto, questo metodo è adatto per uno screening immunologico di veicoli elettrici derivati da cellule tumorali in varie condizioni.

Protocol

All’inizio degli esperimenti, i topi avevano almeno 6 settimane di età e sono stati mantenuti in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. Il presente protocollo è conforme agli standard etici istituzionali e alle normative locali vigenti. Gli studi sugli animali sono stati approvati dall’agenzia di regolamentazione locale (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). Possibili pregiudizi legati al sesso non sono stati studiati in questi studi. 1. Generazione e isolamento di v…

Representative Results

Questo protocollo ha lo scopo di facilitare la valutazione diretta e facilmente riproducibile dell’immunogenicità dei veicoli elettrici derivati dal tumore. Con la presente, i topi vengono inoculati con EV derivati da colture in vitro di cellule tumorali che esprimono l’antigene modello di ovoalbumina di pollo (OVA). La successiva risposta immunitaria viene analizzata nelle cellule T spleniche tramite citometria a flusso. La Figura 1 fornisce un…

Discussion

Questo protocollo fornisce una valutazione immunologica in vivo dei veicoli elettrici derivati da cellule di melanoma sotto stress indotto dalla chemioterapia, adattandosi ai veicoli elettrici emessi da vari tumori sotto vari trattamenti. L’immunizzazione dei topi con EV derivati da cellule B16-OAV trattate con oxaliplatino, ad esempio, espande le cellule T CD8⁺ produttrici di IFN γ nella milza, che sono ulteriormente stimolate dall’incubazione ex vivo con ovoalbumina, indicando una risposta…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)