インビボ 脾臓T細胞のフローサイトメトリーによる腫瘍由来細胞外小胞の免疫原性スクリーニング

Summary

この原稿では、フローサイトメトリーを用いて腫瘍細胞由来細胞外小胞(EV)の in vivo 免疫原性を評価する方法を説明しています。治療誘発免疫原性細胞死を受けている腫瘍に由来するEVは、腫瘍免疫サーベイランスにおいて特に関連しているようである。このプロトコールは、オキサリプラチン誘発免疫刺激性腫瘍EVの評価を例示するが、様々な設定に適合させることができる。

Abstract

化学療法または照射によって引き起こされる腫瘍の免疫原性細胞死は、危険に関連する分子パターンを放出し、I型インターフェロンの産生を誘導することによって、腫瘍特異的T細胞応答を誘発し得る。チェックポイント阻害を含む免疫療法は、治療効果を発現させるために、主に既存の腫瘍特異的T細胞に依存している。したがって、免疫原性細胞死を固有の抗癌ワクチンとして利用する相乗的な治療アプローチは、それらの応答性を改善し得る。しかし、治療誘発ストレス下で細胞によって放出される免疫原性因子のスペクトルは、特に細胞外小胞(EV)に関して、不完全な特徴のままである。EVは、事実上すべての細胞から放出されるナノスケールの膜状粒子であり、細胞間通信を促進すると考えられており、癌では腫瘍抗原に対するクロスプライミングを媒介することが示されている。様々な条件下で腫瘍に由来するEVの免疫原性効果を評価するために、適応性、拡張性、および有効な方法が求められている。したがって、本明細書では、EVsの インビボ 免疫原性を評価するための比較的容易で堅牢なアプローチが提示される。このプロトコールは、マウスをEVで in vivo 免疫した後の脾臓T細胞のフローサイトメトリー分析に基づいており、治療または定常状態条件下での腫瘍細胞培養物からの沈殿ベースのアッセイによって単離された。例えば、この研究は、B16-OVAマウスメラノーマ細胞のオキサリプラチン曝露が、腫瘍反応性細胞傷害性T細胞の活性化を媒介することができる免疫原性EVの放出をもたらしたことを示している。したがって、 in vivo 免疫およびフローサイトメトリーによるEVのスクリーニングは、免疫原性EVが出現し得る条件を特定する。免疫原性EV放出の条件を同定することは、がんに対するEVの治療効果を試験し、根底にある分子メカニズムを探求し、最終的にがん免疫学におけるEVの役割に関する新しい洞察を明らかにするための不可欠な前提条件を提供する。

Introduction

免疫系は、免疫チェックポイント阻害によって誘発された場合および従来の癌治療の有効性の両方において、癌との闘いにおいて極めて重要な役割を果たしている。化学療法剤オキサリプラチンやドキソルビシンなどの遺伝毒性療法、または電離放射線治療に屈した腫瘍細胞は、適応抗腫瘍免疫応答を開始する可能性のある抗原および危険関連分子パターン(DAMP)を放出する可能性があります¹。免疫原性細胞死の文脈で最も顕著なDAMPには、走化性ATPなどのfind-meシグナル、抗原提示細胞による腫瘍細胞の取り込みを促進するカレチクリンの曝露などのeat-meシグナル、およびパターン認識受容体を活性化し、それによって腫瘍抗原の交差提示を増強するHMGB1の放出が含まれる²。さらに、腫瘍由来の免疫原性核酸または他の刺激を介して誘導されるI型インターフェロン(IFN-I)は、樹状細胞によって感知され、腫瘍特異的細胞傷害性T細胞を効果的にプライミングすることを可能にする^3,4。臨床的には、腫瘍に浸潤する活性化および増殖するCD8⁺ T細胞は、多くの癌患者において生存期間を延長するための独立した予後因子を提供する。このような活性化T細胞から放出されるIFN-γは、がん細胞に対する直接的な抗増殖作用を媒介し、Th1分極および細胞傷害性T細胞分化を駆動し、それによってがんに対する効果的な免疫サーベイランスに寄与する^5,6。オキサリプラチンは、がんに対するこのような適応免疫応答を媒介する、正真正銘の免疫原性細胞死誘導物質です⁷。しかし、治療誘発ストレス下で腫瘍細胞によって放出される多数の初期免疫原性シグナルは、まだ完全に明らかにされていない。がん免疫療法の著しい進歩にもかかわらず、その利益をより大きな患者に拡大することは依然として課題である。T細胞活性化を開始する免疫原性シグナルのより詳細な理解は、新規治療法の開発を導く可能性がある。

細胞外小胞(EV)として知られる膜密閉構造の不均一なグループは、細胞間通信デバイスとして機能するようである。事実上すべての細胞型から放出されるEVは、機能的なタンパク質、RNA、DNA、およびその他の分子をレシピエント細胞に運んだり、細胞表面の受容体に結合するだけで細胞の機能状態を変化させる可能性があります。それらの生物学的に活性な貨物は、生成セル⁸の種類および機能状態によって大きく変化する。がん免疫学では、腫瘍細胞から放出されるEVは、最終的に浸潤増殖を促進し、転移ニッチをプリフォーム^し9、免疫応答を抑制するため、免疫療法の敵対的とみなされてきました¹⁰。対照的に、いくつかの研究では、EVが腫瘍抗原を樹状細胞に転写して効果的なクロスプレゼンテーションを行うことができることが示されています^11,12。EVは、治療誘発ストレス下で出現すると免疫刺激核酸を提供し、抗腫瘍免疫応答を促進する可能性があります^13,14。腫瘍微小環境におけるこのようなRNAおよびDNA先天性免疫リガンドの感知は、チェックポイント遮断に対する応答性を有意に調節することが最近示されている¹⁵、^16、17。したがって、異なる治療誘発ストレス下で腫瘍細胞によって放出されるEVの免疫原性の役割は、さらに解明される必要がある。EVは、まだ成長途上の研究分野であるため、手法の標準化はまだ進んでいます。したがって、EVとがん免疫学の相互作用に関する研究再現性を向上させるためには、知識の共有が不可欠です。これを念頭に置いて、この原稿は、インビボでの腫瘍由来EVの免疫原性効果を評価するための簡単なプロトコルを記述している。

この評価は、腫瘍由来のEVを生成し、レシピエントマウスにそれらのEVを免疫し、フローサイトメトリー を介して 脾臓T細胞を分析することによって行われる。EV生成は、理想的には、マウス腫瘍細胞を高純度のEVフリー細胞培養培地に播種することによって行われる。細胞を化学療法などの特定の細胞ストレス刺激で処理し、それぞれの腫瘍由来EVのベースライン免疫原性に対する治療誘発EVの効果を比較する。EVの単離は、 インビボでの 適用性および局所的な利用可能性に応じて選択されるべきである様々な技術によって十分に実施され得る。以下のプロトコールは、EV精製のための市販キットを用いた沈殿ベースのアッセイを記載する。マウスは、これらのEVで2回免疫される。最初の注射から14日後、T細胞を脾臓から抽出し、フローサイトメトリー を介して IFN-γ産生について分析し、全身性免疫応答を評価した。これにより、異なる治療レジメンの下で出現する腫瘍由来EVが抗腫瘍T細胞応答を誘導する可能性が、比較的容易、迅速、かつ高い妥当性で評価される¹³。従って、本方法は、種々の条件下での癌細胞由来のEVの免疫学的スクリーニングに適している。

Protocol

実験の開始時に、マウスは少なくとも6週齢であり、特定の病原体を含まない条件下で維持された。現在の議定書は、制度的倫理基準および一般的な地方規則に準拠しています。動物実験は、地元の規制当局(ドイツ、ミュンヘンのRegierung von Oberbayern)によって承認されました。これらの研究では、性に関連するバイアスの可能性は調査されなかった。 1. 化学療法暴露後の腫?…

Representative Results

このプロトコルは、腫瘍由来EVの免疫原性の簡単で再現性の高い評価を容易にすることを意図している。これにより、マウスは、モデル抗原であるニワトリオボアルブミン(OVA)を発現する腫瘍細胞の in vitro 培養に由来するEVsを接種する。その後の免疫応答は、フローサイトメトリー を介して 脾臓T細胞において分析される。 図 1 に、プ…

Discussion

このプロトコルは、化学療法誘発ストレス下での黒色腫細胞に由来するEVの免疫学的 in vivo 評価を提供し、様々な治療下で様々な癌から放出されるEVに適応する。例えば、オキサリプラチン処理したB16-OVA細胞に由来するEVでマウスを免疫すると、脾臓内のIFN-γ産生CD8⁺ T細胞が拡張され、オボアルブミンとの エクスビボ インキュベーションによってさらに刺激され、腫瘍?…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)