Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Summary

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Abstract

Der durch Chemotherapie oder Bestrahlung verursachte immunogene Zelltod von Tumoren kann tumorspezifische T-Zell-Reaktionen auslösen, indem er gefahrenassoziierte molekulare Muster freisetzt und die Produktion von Typ-I-Interferon induziert. Immuntherapien, einschließlich der Checkpoint-Hemmung, sind in erster Linie auf bereits vorhandene tumorspezifische T-Zellen angewiesen, um eine therapeutische Wirkung zu entfalten. Daher können synergistische Therapieansätze, die den immunogenen Zelltod als intrinsischen Krebsimpfstoff nutzen, ihre Reaktionsfähigkeit verbessern. Das Spektrum immunogener Faktoren, die von Zellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, bleibt jedoch unvollständig charakterisiert, insbesondere in Bezug auf extrazelluläre Vesikel (EVs). EVs, nanoskalige membranöse Partikel, die von praktisch allen Zellen emittiert werden, sollen die interzelluläre Kommunikation erleichtern und bei Krebs nachweislich Cross-Priming gegen Tumorantigene vermitteln. Um die immunogene Wirkung von EVs aus Tumoren unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, werden anpassungsfähige, skalierbare und valide Methoden gesucht. Daher wird hierin ein relativ einfacher und robuster Ansatz zur Beurteilung der In-vivo-Immunogenität von Elektrofahrzeugen vorgestellt. Das Protokoll basiert auf der Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen nach In-vivo-Immunisierung von Mäusen mit EVs, isoliert durch fällungsbasierte Assays aus Tumorzellkulturen unter Therapie oder stationären Bedingungen. Zum Beispiel zeigt diese Arbeit, dass die Oxaliplatin-Exposition von B16-OVA-murinen Melanomzellen zur Freisetzung immunogener EVs führte, die die Aktivierung tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellen vermitteln können. Daher identifiziert das Screening von EVs durch In-vivo-Immunisierung und Durchflusszytometrie Bedingungen, unter denen immunogene EVs entstehen können. Die Identifizierung der Bedingungen der immunogenen EV-Freisetzung ist eine wesentliche Voraussetzung, um die therapeutische Wirksamkeit von EVs gegen Krebs zu testen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erforschen, um letztendlich neue Erkenntnisse über die Rolle von EVs in der Krebsimmunologie zu gewinnen.

Introduction

Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle im Kampf gegen Krebs, sowohl wenn es durch Immun-Checkpoint-Hemmung angeregt wird, als auch für die Wirksamkeit konventioneller Krebstherapien. Tumorzellen, die genotoxischen Therapien wie den Chemotherapeutika Oxaliplatin und Doxorubicin oder der ionisierenden Strahlenbehandlung erliegen, können Antigene und gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) freisetzen, die möglicherweise eine adaptive Antitumor-Immunantwort ^auslösen1. Zu den bekanntesten DAMPs im Zusammenhang mit dem immunogenen Zelltod gehören Find-me-Signale wie chemotaktisches ATP, Eat-Me-Signale wie die Exposition von Calreticulin, das die Aufnahme von Tumorzellen durch Antigen-präsentierende Zellen fördert, und die Freisetzung von HMGB1, das Mustererkennungsrezeptoren aktiviert und dadurch die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen ^verbessert2. Darüber hinaus werden Typ-I-Interferone (IFN-I), die über tumorabgeleitete immunogene Nukleinsäuren oder andere Reize induziert werden, von dendritischen Zellen wahrgenommen, so dass sie tumorspezifische zytotoxische T-Zellen effektiv primieren ^können3,4. Klinisch, aktivierte und proliferierende CD8⁺ T-Zellen, die den Tumor infiltrieren, bieten bei vielen Krebspatienten einen unabhängigen prognostischen Faktor für ein verlängertes Überleben. IFN-γ wird aus solchen aktivierten T-Zellen freigesetzt und vermittelt direkte antiproliferative Wirkungen auf Krebszellen und treibt die Th1-Polarisation und die zytotoxische T-Zell-Differenzierung voran, wodurch es zu einer wirksamen Immunüberwachung gegen Krebs ^beiträgt5,6. Oxaliplatin ist ein echter immunogener Zelltodinduktor, der eine solche adaptive Immunantwort gegen Krebs ^vermittelt7. Die Fülle der anfänglichen immunogenen Signale, die von Tumorzellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, muss jedoch noch vollständig enthüllt werden. Trotz erheblicher Fortschritte in der Krebsimmuntherapie bleibt die Ausweitung des Nutzens auf einen größeren Teil der Patienten eine Herausforderung. Ein detaillierteres Verständnis der immunogenen Signale, die die T-Zell-Aktivierung initiieren, könnte die Entwicklung neuartiger Therapien leiten.

Eine heterogene Gruppe von membranumschlossenen Strukturen, die als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt sind, scheinen als interzelluläre Kommunikationsgeräte zu dienen. EVs, die von praktisch allen Zelltypen emittiert werden, transportieren funktionelle Proteine, RNA, DNA und andere Moleküle zu einer Empfängerzelle oder können den Funktionszustand einer Zelle verändern, indem sie einfach an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Ihre biologisch aktive Fracht variiert erheblich je nach Art und Funktionszustand der erzeugenden ^Zelle8. In der Krebsimmunologie wurden EVs, die aus Tumorzellen freigesetzt werden, überwiegend als Gegner der Immuntherapie angesehen, da sie schließlich das invasive Wachstum fördern, metastasierende ^Nischen9 präformen und die Immunantwort ^{unterdrücken10.} Im Gegensatz dazu haben einige Studien gezeigt, dass EVs Tumorantigene auf dendritische Zellen übertragen können, um eine effektive Kreuzpräsentation zu ^{ermöglichen11,12}. EVs können immunstimulierende Nukleinsäuren liefern, wenn sie unter therapieinduziertem Stress entstehen, was eine Anti-Tumor-Immunantwort ^{ermöglicht13,14}. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Erfassung solcher RNA- und DNA-angeborenen Immunliganden in der Tumormikroumgebung die Reaktionsfähigkeit auf die Checkpoint-Blockade signifikant moduliert15,16,17. Daher muss die immunogene Rolle von EVs, die von Tumorzellen unter verschiedenen therapieinduzierten Belastungen freigesetzt werden, weiter aufgeklärt werden. Da EVs ein junges, aber wachsendes Forschungsfeld darstellen, ist die Standardisierung der Methoden noch nicht abgeschlossen. Daher ist der Austausch von Wissen unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit der Forschung über Wechselwirkungen zwischen EVs und Krebsimmunologie zu verbessern. Vor diesem Hintergrund beschreibt dieses Manuskript ein einfaches Protokoll zur Beurteilung der immunogenen Wirkung von tumorabgeleiteten EVs in vivo.

Diese Bewertung wird durchgeführt, indem tumorabgeleitete EVs erzeugt, Empfängermäuse mit diesen EVs immunisiert und Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Die EV-Erzeugung erfolgt idealerweise durch die Aussaat muriner Tumorzellen in einem EV-freien Zellkulturmedium für einen hohen Reinheitsgrad. Zellen werden mit einem spezifischen Zellstressreiz wie einer Chemotherapie behandelt, um die Wirkung von therapieinduzierten EVs mit der Ausgangsimmunogenität der jeweiligen tumorabgeleiteten EVs zu vergleichen. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen kann durchaus durch verschiedene Techniken erfolgen, die je nach In-vivo-Anwendbarkeit und lokaler Verfügbarkeit ausgewählt werden sollten. Das folgende Protokoll beschreibt einen niederschlagsbasierten Assay mit einem kommerziellen Kit zur EV-Reinigung. Mäuse werden zweimal mit diesen EVs immunisiert. Vierzehn Tage nach der ersten Injektion werden T-Zellen aus der Milz extrahiert und mittels Durchflusszytometrie auf die IFN-γ-Produktion analysiert, um eine systemische Immunantwort zu bewerten. Auf diese Weise wird das Potenzial von tumorabgeleiteten EVs, die unter verschiedenen therapeutischen Therapieschemata entstehen, relativ einfach, schnell und mit hoher Validität ^bewertet13. Daher eignet sich diese Methode für ein immunologisches Screening von EVs aus Krebszellen unter verschiedenen Bedingungen.

Protocol

Zu Beginn der Experimente waren die Mäuse mindestens 6 Wochen alt und wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen gehalten. Das vorliegende Protokoll entspricht den institutionellen ethischen Standards und den geltenden lokalen Vorschriften. Tierversuche wurden von der örtlichen Zulassungsbehörde (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Mögliche geschlechtsspezifische Verzerrungen wurden in diesen Studien nicht untersucht. 1. Erzeugung und Isolierung von EVs aus Tu…

Representative Results

Dieses Protokoll soll die einfache und leicht reproduzierbare Beurteilung der Immunogenität von tumorabgeleiteten EVs erleichtern. Dabei werden Mäuse mit EVs beimpft, die aus In-vitro-Kulturen von Tumorzellen gewonnen werden, die das Modellantigen Hühnerovalbumin (OVA) exprimieren. Die anschließende Immunantwort wird in Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die praktischen Schritte des …

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine immunologische In-vivo-Bewertung von EVs, die aus Melanomzellen unter chemotherapieinduziertem Stress gewonnen werden, während es sich an EVs anpasst, die von verschiedenen Krebsarten unter verschiedenen Behandlungen emittiert werden. Die Immunisierung von Mäusen mit EVs, die aus Oxaliplatin-behandelten B16-OVA-Zellen gewonnen werden, erweitert beispielsweise IFN-γ-produzierende CD8⁺ T-Zellen in der Milz, die durch Ex-vivo-Inkubation mit Ovalbumin weiter stimul…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)