In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Summary

Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.

Abstract

La mort cellulaire immunogène des tumeurs, causée par la chimiothérapie ou l’irradiation, peut déclencher des réponses des lymphocytes T spécifiques à la tumeur en libérant des modèles moléculaires associés au danger et en induisant la production d’interféron de type I. Les immunothérapies, y compris l’inhibition des points de contrôle, reposent principalement sur des cellules T préexistantes spécifiques à la tumeur pour déployer un effet thérapeutique. Ainsi, les approches thérapeutiques synergiques qui exploitent la mort cellulaire immunogène comme vaccin anticancéreux intrinsèque peuvent améliorer leur réactivité. Cependant, le spectre des facteurs immunogènes libérés par les cellules soumises à un stress induit par le traitement reste incomplètement caractérisé, en particulier en ce qui concerne les vésicules extracellulaires (VE). Les VE, des particules membraneuses à l’échelle nanométrique émises par pratiquement toutes les cellules, sont considérés comme facilitant la communication intercellulaire et, dans le cancer, il a été démontré qu’ils médient l’amorçage croisé contre les antigènes tumoraux. Pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs dans diverses conditions, des méthodes adaptables, évolutives et valides sont recherchées. Par conséquent, une approche relativement simple et robuste est présentée ici pour évaluer l’immunogénicité in vivo des VE. Le protocole est basé sur l’analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T spléniques après l’immunisation in vivo de souris avec des VE, isolées par des tests basés sur les précipitations à partir de cultures de cellules tumorales sous thérapie ou dans des conditions d’état d’équilibre. Par exemple, ces travaux montrent que l’exposition à l’oxaliplatine des cellules de mélanome murin B16-OVA a entraîné la libération de VE immunogènes qui peuvent servir de médiateur dans l’activation des lymphocytes T cytotoxiques réactifs à la tumeur. Par conséquent, le dépistage des VE par immunisation in vivo et cytométrie en flux identifie les conditions dans lesquelles les VE immunogènes peuvent émerger. L’identification des conditions de libération immunogène des VE fournit une condition préalable essentielle pour tester l’efficacité thérapeutique des VE contre le cancer et explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents afin de dévoiler de nouvelles perspectives sur le rôle des VE dans l’immunologie du cancer.

Introduction

Le système immunitaire joue un rôle central dans la lutte contre le cancer, à la fois lorsqu’il est incité par l’inhibition du point de contrôle immunitaire et pour l’efficacité des thérapies conventionnelles contre le cancer. Les cellules tumorales succombant à des thérapies génotoxiques telles que les agents chimiothérapeutiques oxaliplatine et doxorubicine, ou la radiothérapie ionisante peuvent libérer des antigènes et des modèles moléculaires associés au danger (DAMP) qui initient potentiellement une réponse immunitaire antitumorale ^adaptative1. Les DAMP les plus importants, dans le contexte de la mort cellulaire immunogène, comprennent les signaux find-me tels que l’ATP chimiotactique, les signaux eat-me tels que l’exposition à la calréticuline, qui favorise l’absorption des cellules tumorales par les cellules présentatrices d’antigènes, et la libération de HMGB1, qui active les récepteurs de reconnaissance de formes, améliorant ainsi la présentation croisée des antigènes ^tumoraux2. En outre, les interférons de type I (IFN-I), induits par des acides nucléiques immunogènes dérivés de tumeurs ou d’autres stimuli, sont détectés par les cellules dendritiques, ce qui leur permet d’amorcer efficacement les cellules T cytotoxiques spécifiques à la ^tumeur3,4. Cliniquement, les lymphocytes T CD8⁺ activés et proliférants infiltrant la tumeur fournissent un facteur pronostique indépendant pour une survie prolongée chez de nombreux patients atteints de cancer. Libéré par ces lymphocytes T activés, l’IFN-γ médie les effets antiprolifératifs directs sur les cellules cancéreuses et entraîne la polarisation Th1 et la différenciation des lymphocytes T cytotoxiques, contribuant ainsi à une immunosurveillance efficace contre le ^cancer5,6. L’oxaliplatine est un véritable inducteur immunogène de la mort cellulaire, médiant une telle réponse immunitaire adaptative contre le ^cancer7. Cependant, la pléthore de signaux immunogènes initiaux libérés par les cellules tumorales sous stress induit par le traitement reste à dévoiler pleinement. Malgré les progrès significatifs de l’immunothérapie du cancer, l’extension de ses avantages à une plus grande partie des patients reste un défi. Une compréhension plus détaillée des signaux immunogènes qui initient l’activation des lymphocytes T pourrait guider le développement de nouvelles thérapies.

Un groupe hétérogène de structures enfermées dans la membrane, connues sous le nom de vésicules extracellulaires (VE), semble servir de dispositifs de communication intercellulaire. Émis par pratiquement tous les types de cellules, les VE transportent des protéines fonctionnelles, de l’ARN, de l’ADN et d’autres molécules vers une cellule réceptrice ou peuvent modifier l’état fonctionnel d’une cellule simplement en se liant aux récepteurs à la surface de la cellule. Leur cargaison biologiquement active varie considérablement selon le type et l’état fonctionnel de la cellule ^{génératrice8}. En immunologie du cancer, les VE libérés par les cellules tumorales ont été principalement considérés comme antagonistes à l’immunothérapie parce qu’ils finissent par favoriser la croissance invasive, préformer des niches métastatiques9 et supprimer la réponse ^{immunitaire10}. En revanche, certaines études ont montré que les VE peuvent transférer des antigènes tumoraux aux cellules dendritiques pour une présentation croisée ^{efficace11,12}. Les VE peuvent fournir des acides nucléiques immunostimulants s’ils émergent sous un stress induit par le traitement, facilitant une réponse immunitaire ^{antitumorale13,14}. Il a récemment été démontré que la détection de tels ligands immunitaires innés à l’ARN et à l’ADN dans le microenvironnement tumoral module de manière significative la réactivité au blocage des points de contrôle15,16,17. Par conséquent, le rôle immunogène des VE libérés par les cellules tumorales sous différents stress induits par la thérapie doit être élucidé davantage. Étant donné que les véhicules électriques constituent un domaine de recherche jeune mais en pleine croissance, la normalisation des méthodes est toujours en cours. Par conséquent, le partage des connaissances est essentiel pour améliorer la reproductibilité de la recherche sur les interactions entre les VE et l’immunologie du cancer. Dans cet esprit, ce manuscrit décrit un protocole simple pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs in vivo.

Cette évaluation est réalisée en générant des VE dérivés de tumeurs, en immunisant les souris réceptrices avec ces VE et en analysant les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux. La génération de VE est idéalement réalisée en ensemençant des cellules tumorales murines dans un milieu de culture cellulaire sans EV pour un haut degré de pureté. Les cellules sont traitées avec un stimulus de stress cellulaire spécifique, tel que la chimiothérapie, pour comparer l’effet des VE induits par le traitement à l’immunogénicité de base des VE dérivés de tumeurs respectifs. L’isolement des véhicules électriques peut très bien être effectué par diverses techniques qui doivent être sélectionnées en fonction de l’applicabilité in vivo et de la disponibilité locale. Le protocole suivant décrit un test basé sur les précipitations avec un kit commercial pour la purification des véhicules électriques. Les souris sont immunisées deux fois avec ces VE. Quatorze jours après la première injection, les lymphocytes T sont extraits de la rate et analysés pour la production d’IFN-γ par cytométrie en flux afin d’évaluer une réponse immunitaire systémique. Avec cela, le potentiel des VE dérivés de tumeurs, émergeant sous différents schémas thérapeutiques, pour induire des réponses anti-cellules T tumorales est évalué relativement facilement, rapidement et avec une validité ^élevée13. Par conséquent, cette méthode convient à un dépistage immunologique des VE dérivés de cellules cancéreuses dans diverses conditions.

Protocol

Au début des expériences, les souris étaient âgées d’au moins 6 semaines et étaient maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Le présent protocole est conforme aux normes éthiques institutionnelles et aux réglementations locales en vigueur. Les études sur les animaux ont été approuvées par l’organisme de réglementation local (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Les biais possibles liés au sexe n’ont pas été étudiés dans ces études. <p class="jove_…

Representative Results

Ce protocole vise à faciliter l’évaluation simple et facilement reproductible de l’immunogénicité des VE dérivés de tumeurs. Ainsi, les souris sont inoculées avec des VE dérivées de cultures in vitro de cellules tumorales exprimant l’antigène modèle de l’ovalbumine de poulet (OVA). La réponse immunitaire subséquente est analysée dans les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux. La figure 1 donne un aperçu des éta…

Discussion

Ce protocole fournit une évaluation immunologique in vivo des VE dérivés de cellules de mélanome sous stress induit par la chimiothérapie tout en s’adaptant aux VE émis par divers cancers sous divers traitements. L’immunisation des souris avec des VE dérivés de cellules B16-OVA traitées à l’oxaliplatine, par exemple, élargit les lymphocytes T CD8⁺ producteurs d’IFN-γ dans la rate, qui sont ensuite stimulés par incubation ex vivo avec de l’ovalbumine, indiquant une répo…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)