В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Summary

В этой рукописи описывается, как оценить иммуногенность in vivo внеклеточных везикул опухолевых клеток (EV) с помощью проточной цитометрии. EV, полученные из опухолей, подвергающихся иммуногенной гибели клеток, вызванной лечением, кажутся особенно актуальными при иммунооперации опухолей. Этот протокол иллюстрирует оценку оксалиплатин-индуцированных иммуностимулирующих опухолевых EV, но может быть адаптирован к различным условиям.

Abstract

Иммуногенная гибель клеток опухолей, вызванная химиотерапией или облучением, может вызывать специфические для опухоли ответы Т-клеток, высвобождая связанные с опасностью молекулярные паттерны и индуцируя выработку интерферона I типа. Иммунотерапия, включая ингибирование контрольных точек, в первую очередь полагается на ранее существовавшие опухолеспецифические Т-клетки для раскрытия терапевтического эффекта. Таким образом, синергетические терапевтические подходы, которые используют иммуногенную гибель клеток в качестве внутренней противораковой вакцины, могут улучшить их реакцию. Однако спектр иммуногенных факторов, высвобождаемых клетками при стрессе, вызванном терапией, остается неполностью охарактеризованным, особенно в отношении внеклеточных везикул (EV). Считается, что EV, наноразмерные мембранные частицы, испускаемые практически из всех клеток, облегчают межклеточную связь и, при раке, опосредуют перекрестное праймирование против опухолевых антигенов. Для оценки иммуногенного эффекта EV, полученных из опухолей в различных условиях, ищутся адаптируемые, масштабируемые и валидные методы. Таким образом, в настоящем документе представлен относительно простой и надежный подход к оценке иммуногенности EV in vivo . Протокол основан на анализе проточной цитометрии селезеночных Т-клеток после иммунизации in vivo мышей EV, выделенных путем анализа на основе осаждения из культур опухолевых клеток в условиях терапии или стационарного состояния. Например, эта работа показывает, что воздействие оксалиплатина на клетки мышиной меланомы B16-OVA привело к высвобождению иммуногенных EV, которые могут опосредуть активацию опухолеспособных цитотоксических Т-клеток. Следовательно, скрининг EV с помощью иммунизации in vivo и проточной цитометрии выявляет условия, при которых могут возникать иммуногенные EV. Выявление условий иммуногенного высвобождения EV обеспечивает важную предпосылку для тестирования терапевтической эффективности EV против рака и изучения основных молекулярных механизмов, чтобы в конечном итоге раскрыть новое понимание роли EV в иммунологии рака.

Introduction

Иммунная система играет ключевую роль в борьбе с раком, как при инспирировании ингибирования иммунных контрольных точек, так и для эффективности традиционных методов лечения рака. Опухолевые клетки, поддающиеся генотоксической терапии, такой как химиотерапевтические агенты оксалиплатин и доксорубицин, или ионизирующее лучевое лечение, могут высвобождать антигены и связанные с опасностью молекулярные паттерны (DAMP), которые потенциально инициируют адаптивный противоопухолевый иммунный ^ответ1. Наиболее известные DAMP, в контексте иммуногенной гибели клеток, включают сигналы find-me, такие как хемотаксическая АТФ, сигналы eat-me, такие как воздействие калретикулина, который способствует поглощению опухолевых клеток антигенпрезентирующими клетками, и высвобождение HMGB1, который активирует рецепторы распознавания образов, тем самым усиливая перекрестную презентацию опухолевых ^{антигенов2}. Кроме того, интерфероны типа I (IFN-I), индуцированные через иммуногенные нуклеиновые кислоты или другие стимулы, полученные из опухоли, воспринимаются дендритными клетками, что позволяет им эффективно праймировать опухолеспецифические цитотоксические Т-клетки3,4. Клинически активированные и пролиферирующие CD8⁺ Т-клетки, проникающие в опухоль, обеспечивают независимый прогностический фактор для длительной выживаемости у многих больных раком. Высвобождаемый из таких активированных Т-клеток, IFN-γ опосредует прямое антипролиферативное воздействие на раковые клетки и стимулирует поляризацию Th1 и цитотоксическую дифференцировку Т-клеток, тем самым способствуя эффективному иммунонадзору против ^рака5,6. Оксалиплатин является добросовестным иммуногенным индуктором гибели клеток, опосредующим такой адаптивный иммунный ответ против ^рака7. Тем не менее, множество исходных иммуногенных сигналов, высвобождаемых опухолевыми клетками при стрессе, вызванном терапией, еще предстоит полностью раскрыть. Несмотря на значительные достижения в иммунотерапии рака, расширение ее преимуществ для большей части пациентов остается проблемой. Более подробное понимание иммуногенных сигналов, которые инициируют активацию Т-клеток, может направлять разработку новых методов лечения.

Гетерогенная группа мембранно-замкнутых структур, известная как внеклеточные везикулы (EV), по-видимому, служит межклеточными устройствами связи. Излучаемые практически всеми типами клеток, EV переносят функциональные белки, РНК, ДНК и другие молекулы в клетку-реципиент или могут изменять функциональное состояние клетки, просто связываясь с рецепторами на поверхности клетки. Их биологически активный груз значительно варьируется в зависимости от типа и функционального состояния генерирующей ^{ячейки8}. В иммунологии рака EV, высвобождаемые из опухолевых клеток, преимущественно рассматриваются как противоборствующие иммунотерапии, потому что они в конечном итоге способствуют инвазивному росту, преформируют метастатические ^ниши9 и подавляют иммунный ^ответ10. Напротив, некоторые исследования показали, что EV могут переносить опухолевые антигены в дендритные клетки для эффективного перекрестного ^{представления11,12}. EV могут обеспечивать иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, если они возникают при стрессе, вызванном терапией, облегчая противоопухолевый иммунный ^{ответ13,14}. Недавно было показано, что зондирование таких врожденных иммунных лигандов РНК и ДНК в микроокружении опухоли модулирует реакцию на блокаду контрольных точек 15,16,17. Следовательно, иммуногенная роль EV, высвобождаемых опухолевыми клетками при различном стрессе, вызванном терапией, должна быть дополнительно выяснена. Поскольку электромобили представляют собой молодую, но растущую область исследований, стандартизация методов все еще продолжается. Поэтому обмен знаниями имеет важное значение для улучшения воспроизводимости исследований взаимодействий между EV и иммунологией рака. Имея это в виду, эта рукопись описывает простой протокол оценки иммуногенного эффекта опухолевых EV in vivo.

Эта оценка выполняется путем генерации ЭВ, полученных из опухоли, иммунизации мышей-реципиентов этими ЭВ и анализа селезеночных Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Генерация EV идеально выполняется путем посева опухолевых клеток мышей в культурную среду без EV для высокой степени чистоты. Клетки обрабатывают специфическим стимулом клеточного стресса, таким как химиотерапия, чтобы сравнить эффект индуцированных терапией EV с базовой иммуногенностью соответствующих EV, полученных из опухоли. Изоляция электромобилей вполне может быть выполнена различными методами, которые должны быть выбраны в соответствии с применимостью in vivo и местной доступностью. Следующий протокол описывает анализ на основе осаждения с коммерческим комплектом для очистки электромобилей. Мыши дважды иммунизируются этими электромобилями. Через четырнадцать дней после первой инъекции Т-клетки извлекаются из селезенки и анализируются на производство IFN-γ с помощью проточной цитометрии для оценки системного иммунного ответа. При этом потенциал опухолевых EV, возникающих при различных терапевтических схемах, для индуцирования противоопухолевых Т-клеточных ответов оценивается относительно легко, быстро и с высокой ^{валидностью13}. Поэтому этот метод подходит для иммунологического скрининга EV, полученных из раковых клеток в различных условиях.

Protocol

В начале экспериментов мышам было не менее 6 недель и они содержались в определенных условиях, свободных от патогенов. Настоящий протокол соответствует институциональным этическим нормам и действующим местным нормам. Исследования на животных были одобрены местным регулирующим орган?…

Representative Results

Этот протокол предназначен для облегчения простой и легко воспроизводимой оценки иммуногенности ЭВ, полученных из опухоли. Таким образом, мышей прививают EV, полученными из культур опухолевых клеток in vitro , экспрессирующих модельный антиген куриного овальбумина (OVA). Последующий им…

Discussion

Этот протокол обеспечивает иммунологическую оценку in vivo EV, полученных из клеток меланомы при стрессе, вызванном химиотерапией, при адаптации к EV, испускаемым различными видами рака при различных методах лечения. Например, иммунизация мышей EV, полученными из клеток B16-OVA, обработанн…

Materials

Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Cell Strainer, 100 µm	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µm
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43	Fixation/Permeabilization Concentrate (10x)
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Pharmacy of MRI hospital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC)
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane
Red Blood Cell Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES
Syringe, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm)
Total Exosome Isolation Reagent	Invitrogen	4478359	For isolation from cell culture media
β-Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β-Mercaptoethanol (50 mM)