Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV’s) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV’s afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV’s, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.
Immunogene celdood van tumoren, veroorzaakt door chemotherapie of bestraling, kan tumorspecifieke T-celreacties veroorzaken door gevaargerelateerde moleculaire patronen vrij te geven en de productie van type I-interferon te induceren. Immunotherapieën, waaronder checkpoint-remming, vertrouwen voornamelijk op reeds bestaande tumorspecifieke T-cellen om een therapeutisch effect te ontvouwen. Synergetische therapeutische benaderingen die immunogene celdood gebruiken als een intrinsiek antikankervaccin kunnen dus hun reactievermogen verbeteren. Het spectrum van immunogene factoren die vrijkomen door cellen onder therapie-geïnduceerde stress blijft echter onvolledig gekarakteriseerd, vooral met betrekking tot extracellulaire blaasjes (EV’s). EV’s, vliezige deeltjes op nanoschaal die door vrijwel alle cellen worden uitgestoten, worden beschouwd als vergemakkelijken intercellulaire communicatie en bij kanker is aangetoond dat ze cross-priming tegen tumorantigenen bemiddelen. Om het immunogene effect van EV’s afgeleid van tumoren onder verschillende omstandigheden te beoordelen, wordt gezocht naar aanpasbare, schaalbare en geldige methoden. Daarom wordt hierin een relatief eenvoudige en robuuste aanpak gepresenteerd om de in vivo immunogeniciteit van EV’s te beoordelen. Het protocol is gebaseerd op flowcytometrie-analyse van milt T-cellen na in vivo immunisatie van muizen met EV’s, geïsoleerd door op neerslag gebaseerde assays van tumorcelculturen onder therapie of steady-state omstandigheden. Dit werk toont bijvoorbeeld aan dat oxaliplatineblootstelling van B16-OVA-muizenmelanoomcellen resulteerde in de afgifte van immunogene EV’s die de activering van tumorreactieve cytotoxische T-cellen kunnen bemiddelen. Daarom identificeert screening van EV’s via in vivo immunisatie en flowcytometrie omstandigheden waaronder immunogene EV’s kunnen ontstaan. Het identificeren van de voorwaarden voor immunogene EV-afgifte biedt een essentiële voorwaarde voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van EV’s tegen kanker en het verkennen van de onderliggende moleculaire mechanismen om uiteindelijk nieuwe inzichten te onthullen in de rol van EV’s in de immunologie van kanker.
Het immuunsysteem speelt een cruciale rol in de strijd tegen kanker, zowel wanneer het wordt aangezet door immuuncheckpointremming als voor de werkzaamheid van conventionele kankertherapieën. Tumorcellen die bezwijken voor genotoxische therapieën zoals de chemotherapeutische middelen oxaliplatine en doxorubicine, of ioniserende bestralingsbehandeling kunnen antigenen en gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) vrijgeven die mogelijk een adaptieve anti-tumor immuunrespons initiëren1. De meest prominente DAMPs, in de context van immunogene celdood, omvatten find-me-signalen zoals chemotactische ATP, eat-me-signalen zoals de blootstelling van calreticuline, die de opname van tumorcellen door antigeen-presenterende cellen bevordert, en de afgifte van HMGB1, die patroonherkenningsreceptoren activeert, waardoor de kruispresentatie van tumorantigenen2 wordt verbeterd. Bovendien worden type I-interferonen (IFN-I), geïnduceerd via tumor-afgeleide immunogene nucleïnezuren of andere stimuli, waargenomen door dendritische cellen, waardoor ze tumorspecifieke cytotoxische T-cellen effectief kunnen primen3,4. Klinisch gezien bieden geactiveerde en prolifererende CD8 + T-cellen die de tumor infiltreren een onafhankelijke prognostische factor voor langdurige overleving bij veel kankerpatiënten. Vrijgegeven uit dergelijke geactiveerde T-cellen, bemiddelt IFN-γ directe antiproliferatieve effecten op kankercellen en drijft Th1-polarisatie en cytotoxische T-celdifferentiatie aan, waardoor wordt bijgedragen aan effectieve immunosurveillance tegen kanker5,6. Oxaliplatine is een bonafide immunogene celdoodinductor, die een dergelijke adaptieve immuunrespons tegen kanker bemiddelt7. De overvloed aan initiële immunogene signalen die door tumorcellen worden afgegeven onder door therapie veroorzaakte stress, moet echter nog volledig worden onthuld. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in kankerimmunotherapie, blijft het uitbreiden van de voordelen ervan naar een groter deel van de patiënten een uitdaging. Een meer gedetailleerd begrip van immunogene signalen die T-celactivatie initiëren, kan de ontwikkeling van nieuwe therapieën begeleiden.
Een heterogene groep van membraan-ingesloten structuren, bekend als extracellulaire blaasjes (EV’s), lijken te dienen als intercellulaire communicatie-apparaten. Uitgezonden door vrijwel alle celtypen, dragen EV’s functionele eiwitten, RNA, DNA en andere moleculen naar een ontvangende cel of kunnen de functionele toestand van een cel veranderen door zich te binden aan receptoren op het celoppervlak. Hun biologisch actieve lading varieert aanzienlijk door het type en de functionele toestand van de genererende cel8. In de kankerimmunologie worden EV’s die vrijkomen uit tumorcellen voornamelijk beschouwd als vijandig tegenover immunotherapie omdat ze uiteindelijk invasieve groei bevorderen, gemetastaseerde niches prevormen9 en de immuunrespons onderdrukken10. Daarentegen hebben sommige studies aangetoond dat EV’s tumorantigenen kunnen overbrengen naar dendritische cellen voor effectieve kruispresentatie11,12. EV’s kunnen immunostimulerende nucleïnezuren leveren als ze ontstaan onder door therapie geïnduceerde stress, waardoor een antitumorimmuunrespons wordt vergemakkelijkt13,14. Het is onlangs aangetoond dat detectie van dergelijke RNA- en DNA-aangeboren immuunliganden in de micro-omgeving van de tumor de responsiviteit op checkpointblokkade aanzienlijk moduleert15,16,17. Daarom moet de immunogene rol van EV’s die vrijkomen door tumorcellen onder verschillende therapie-geïnduceerde stress verder worden opgehelderd. Aangezien EV’s een jong maar groeiend onderzoeksgebied vormen, is de standaardisatie van methoden nog steeds aan de gang. Daarom is het delen van kennis essentieel om de reproduceerbaarheid van onderzoek naar interacties tussen EV’s en kankerimmunologie te verbeteren. Met dit in gedachten beschrijft dit manuscript een eenvoudig protocol om het immunogene effect van tumor-afgeleide EV’s in vivo te beoordelen.
Deze beoordeling wordt uitgevoerd door tumor-afgeleide EV’s te genereren, ontvangende muizen met die EV’s te immuniseren en milt-T-cellen te analyseren via flowcytometrie. EV-generatie wordt idealiter uitgevoerd door muriene tumorcellen te zaaien in een EV-vrij celkweekmedium voor een hoge mate van zuiverheid. Cellen worden behandeld met een specifieke celstressprikkel, zoals chemotherapie, om het effect van therapie-geïnduceerde EV’s te vergelijken met baseline immunogeniciteit van de respectieve tumor-afgeleide EV’s. De isolatie van EV’s kan heel goed worden uitgevoerd door verschillende technieken die moeten worden geselecteerd op basis van in vivo toepasbaarheid en lokale beschikbaarheid. Het volgende protocol beschrijft een op neerslag gebaseerde test met een commerciële kit voor EV-zuivering. Muizen worden twee keer geïmmuniseerd met die EV’s. Veertien dagen na de eerste injectie worden T-cellen uit de milt geëxtraheerd en geanalyseerd op IFN-γ productie via flowcytometrie om een systemische immuunrespons te evalueren. Hiermee wordt het potentieel van tumor-afgeleide EV’s, die onder verschillende therapeutische regimes ontstaan, om anti-tumor T-celresponsen te induceren relatief eenvoudig, snel en met hoge validiteit beoordeeld13. Daarom is deze methode geschikt voor een immunologische screening van EV’s afgeleid van kankercellen onder verschillende omstandigheden.
Dit protocol biedt een immunologische in vivo beoordeling van EV’s afgeleid van melanoomcellen onder chemotherapie-geïnduceerde stress, terwijl het zich aanpast aan EV’s die worden uitgezonden door verschillende kankers onder verschillende behandelingen. Het immuniseren van muizen met EV’s afgeleid van met oxaliplatine behandelde B16-OVA-cellen, bijvoorbeeld, breidt IFN-γ-producerende CD8 + T-cellen in de milt uit, die verder worden gestimuleerd door ex vivo incubatie met ovalbumine, wat wi…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) – Projektnummer 360372040 – SFB 1335 en Projektnummer 395357507 – SFB 1371 (aan H.P.), een Mechtild Harf Research Grant van de DKMS Foundation for Giving Life (aan H.P.), een Young Investigator Award van de Melanoma Research Alliance (aan S.H.), een beurs van de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (aan F.S.), een Seed Fund van de Technische Universiteit München (aan S.H.) en een onderzoekssubsidie van de Wilhelm Sander Stichting (2021.041.1, aan S.H.). H.P. wordt ondersteund door het EMBO Young Investigator Program.
BIJDRAGEN VAN DE AUTEUR:
F.S., H.P. en S.H. ontwierpen het onderzoek, analyseerden en interpreteerden de resultaten. F.S. en S.H. schreven het manuscript. H.P. en S.H. begeleidden het onderzoek.
Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus – CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin – CAS 9006-59-1 |
Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |