Oikopleura dioica biyolojinin çeşitli alanlarında bir tunicate model organizmadır. Biz örnekleme yöntemleri, türlerin belirlenmesi, kültür kurulum ve hayvanlar ve alg yem için culturing protokolleri açıklar. Kültür sisteminin güçlendirilmesine yardımcı olan temel faktörleri vurguluyor ve olası sorunları ve çözümleri tartışıyoruz.
Oikopleura dioica olağanüstü filtre besleme yeteneği, hızlı üretim süresi, korunmuş erken gelişim ve kompakt genom ile bir planktonik akorat olduğunu. Bu nedenlerden dolayı, deniz ekolojik çalışmaları, evrimsel gelişimbiyolojisi ve genomik için yararlı bir model organizma olarak kabul edilir. Araştırma genellikle hayvan kaynaklarının sürekli bir kaynağı gerektirir gibi, güvenilir, düşük bakım kültür sistemi kurmak için yararlıdır. Burada bir O. dioica kültürü oluşturmak için adım adım yöntemi açıklar. Potansiyel örnekleme alanlarının nasıl seçiliş yöntemini, toplama yöntemlerini, hedef hayvan tanımlamasını ve kültür sisteminin kurulumlarını açıklarız. Kendi deneyimlerimize dayalı olarak sorun giderme önerileri sayılmaktayız. Ayrıca, sağlam bir kültür sisteminin sürdürülmesine yardımcı olan kritik faktörleri de vurguluyoruz. Burada sağlanan kültür protokolü O. dioicaiçin optimize edilmiş olsa da, örnekleme tekniğimizin ve kültür kurulumuzun diğer kırılgan pelajik omurgasızları korumak için yeni fikirlere ilham vermesini umuyoruz.
Model organizmalar, gelişim, genetik ve fizyoloji ile ilgili olanlar da dahil olmak üzere birçok biyolojik sorunun ele alınmasında etkili olmuştur. Ayrıca, ek model organizmalar yeni keşifler kolaylaştırmak ve bu nedenle doğanın daha büyük bir anlayış elde etmek için çok önemlidir1,2. Deniz zooplankton okyanus ekosistemleriönemlibir rol oynayan organizmaların çeşitli gruplar 3,4,5,6. Onların bolluk ve ekolojik önemine rağmen, planktonik tunicates gibi jelatinimsi organizmalar genellikle altında plankton biyolojik çeşitlilik çalışmalarında temsil edilmektedir çünkü şeffaflık ve kırılganlık alan toplama ve kimlik meydan yapmak7,8. Adapte örnekleme teknikleri ve laboratuvar culturing planktonik tunicates9,10,11,12biyoloji bilgi ilerletmiştir in vitro, hayvanların daha yakından gözlem sağlar.
Larvaceans (Apendicularians) dünya çapında yaklaşık 70 tanımlanan türler 8 oluşan serbest yüzme deniz tunicates bir sınıftır8,13. Onlar zooplankton topluluklar içinde en bol gruplardan biri olduğu gibi14,15,16,17, larvaceans balık larvaları gibi büyük planktonik organizmalar için birincil besin kaynağı temsil18,19. Ascidians aksine-sessile tunicates-larvaceans bir kurbağa yavrusu gibi morfoloji korumak ve yaşamları boyunca planktonik kalır20. Her hayvan, ev olarak bilinen kendi kendini inşa edilmiş, karmaşık bir filtre besleme yapısı içinde yaşar. Kuyruklarının dalgalı hareketi ile su akıntıları oluşturarak evlerinde partiküller birikirler21. Tıkanmış evler gün boyunca atılır, bazıları karbon agregaları oluşturur ve sonunda deniz tabanına22lavabo; böylece, larvaceans küresel karbon akısı önemli bir rol oynamaktadır23. Çoğu türün13no’lsu su sütununun üst 100 m’si içinde pelajik bölgede yaşadığı bildirilir; ancak, dev larvacean Bathochordaeus 300 m24derinliklerinde yaşadığı bilinmektedir. Monterey Bay Bathochordaeus bir çalışma, Kaliforniya hayvanların da mikroplastik biyolojik bir vektör olarak hizmet ortaya, okyanuslarda mikroplastikdikey taşıma ve dağılımında apandisisitlerin rolünü anlamada potansiyel bir önem düşündüren25.
Oikopleura dioica, larvacean bir tür, birkaç dikkat çekici özellikleri nedeniyle bir model organizma olarak son yıllarda dikkat çekti. Genellikle dünya okyanuslarında rapor edilir. Özellikle kıyı sularında bol miktarda bulunur26, kıyıdan kolay örnekleme sağlar. Uzun süreli, stabil kültür hem doğal hem de yapay deniz suyu27,,28,29ile mümkündür. Sıcaklık bağımlı üretim süreleri laboratuvar koşullarında 4-9 gün kadar kısadır. Yıl boyunca >300 yumurta üretebilen her dişi ile yüksek bir fecundity vardır. Bir tunicate olarak, kordevrim30,31anlamak için önemli bir filogenetik konuma sahiptir. 70 Mb’de, O. dioica tüm kordates32arasında en küçük tanımlanmış genoma sahiptir. Larvaceans arasında, O. dioica şimdiye kadar açıklanan tek non-hermafrodit türler33.
Laboratuvar yetiştirilen mikroalg ile ilk başarılı O. dioica kültürü Paffenhöfer34tarafından bildirilmiştir . Senkron motorlar ve kürekler kullanılarak orijinal kültür protokolü Fenaux ve Gorsky35 tarafından geliştirilmiş ve daha sonra birden fazla laboratuvar tarafından kabul edilmiştir. Daha yakın zamanda, Fujii ve ark36 yapay deniz suyunda O. dioica culturing bildirdi, sağlam bir kültür sistemi ve alan koleksiyonu Buket ve ark.27 tarafından tarif edildi ve basitleştirilmiş için optimize edilmiş bir protokol, uygun fiyatlı sistem Marti-Solans ve ark.29tarafından bildirilmiştir . Kenara geleneksel Oikopleura kültür sistemi, bir çift tüp yetiştirme tankı ile yeni bildirilen tasarım da kültür Oikopleura sp potansiyeline sahiptir. 37′ye kadar.
Biz Sars Uluslararası Deniz Moleküler Biyoloji Merkezi27büyük Oikopleura araştırma grupları tarafından geliştirilen protokollerin bir arada dayalı bir O. dioica monokültür başlatmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz , Barselona Üniversitesi29, Osaka Üniversitesi28, ve kendi gözlemler. Daha önce yayınlanmış kültür protokollerinde, alg medyasının bileşimi, kıyı örnekleme teknikleri ve Oikopleura tanımlaması ile ilgili ayrıntılı bilgiler kabaca açıklanmış ve bu da çok fazla belirsizlik bırakarak tanımlanmıştır. Burada, video protokolündeki görsel bilgilerin yardımıyla, bir O. dioica kültürünü sıfırdan kurmak için gereken tüm kritik bilgileri adım adım basit bir şekilde bir araya getirdik. Biz nasıl başka bir yaygın olarak bildirilen türler, O. longicauda,en zorlu adımlardan biridir O. dioica ayırt etmek için açıklar. Mevcut kültür sistemleri dünya çapında O. dioica ekimi için geçerli olmasına rağmen, yerel çevre koşullarına dayalı protokol ayarlamasının önemini vurguluyoruz. Sunulan bilgiler, yaygın olarak yayınlanan verilerin yanı sıra deneyimle kazanılan bilgileri de birleştirir. Mevcut protokol, sıfırdan bir kültür oluşturmak isteyen araştırmacılar için idealdir.
O. dioica kültürünün kurulmasında esnekliği kolaylaştırmak için hayvanların doğal yaşam alanlarını anlamak önemlidir. Mevsimsel veriler, laboratuvar culturing koşullarına rehberlik etmek için kullanılabilecek fiziksel parametrelerin aralıkları hakkında bilgi sağlar. Aynı zamanda hayvan bolluğu mevsimsel dalgalanmalar anlamada yardımcı olur. Okinawa’da, O. dioica en güvenilir Haziran-Ekim arasında bulunur. Ancak, Tokyo koyunda, nüfus Şubat ve Ekim41’dezirve . O. dioica’nın kültüretür genellikle 20 °C veya daha düşük27,28,29, Okinawan O. dioica 20 °C’nin üzerindeki sıcaklıklarda daha iyi sağkalım gösterir; Bu durum Okinawa’daki minimum yüzey deniz suyu sıcaklığının ~20 °C(Şekil 6)olmasıyla açıklanabilir. O. dioica bolluğu da fitoplankton çiçek42 ve yırtıcı bolluk43,,44etkilenmiş olabilir. O. dioica’nın nerede toplandığına bakılmaksızın, yerel popülasyonların mevsimselliğini anlamak örnekleme ve başarı yıkma şansını en üst düzeye çıkarır.
Uygun sezon ve konum göz önüne alındığında, net örnekleme en az çaba ile Oikopleura çok sayıda toplama etkili bir yoludur. Hayvanların tüm aşamalarını toplamak için daha küçük ağ boyutuna (60-70 μm) sahip plankton ağları da kullanılabilir. Tamamen olgun hayvanlar nadiren net bulunur, belki de yaşam döngüsünün sonunda kırılganlık nedeniyle. Bu nedenle, örnekleme ile takip edilen türlerin tanımlanması subkord hücrelerinin mikroskobik gözlemi ile elde edilir. Hayvanlar laboratuvarda büyümeye devam ettikçe olgun bireyler genellikle örnekleme sonrası bir veya iki gün görünürler. Net örnekleme verimli olmasına rağmen, farklı durumlarda alternatif örnekleme yöntemleri gerekebilir. Örneğin, kentsel alanlarda yakın net örnekleme fitoplankton çok sayıda toplayabilir, zor Oikopleuraizole etmek için yapım . Bu gibi durumlarda, liman dışındaki alanlardan yüzey deniz suyu veya tekne örneklemetoplamak için basit kova örneklemesi önerilir. Sonuçlar, yağmur ardışık gün nedeniyle tuzluluk kademeli değişim O. dioicabolluğu etkilemediğini gösterdi ; ancak tropikal siklonlar gibi aşırı hava olaylarından hemen sonra kıyı örneklemesi önlenmelidir. Bu olaylar su korunaklı bir vücutta ani ve şiddetli biyojeokimyasal değişikliklere neden45,46. Yağmur suyu akıntısı kirleticiler, tortular ve bulanıklık ve düşük su kalitesini artırmak aşırı besin taşıyabilir47. Filtre besleme planktonları, Oikopleuragibi , özellikle beslenme ve sınırlı hareketlilik onların modu nedeniyle bu değişikliklere duyarlı olabilir. Böyle bir durumda, yerel koşullar normale dönene kadar örneklemenin birkaç gün ertelenmesini öneririz.
O. dioicagibi küçük, filtre beslemeli organizmaları korumak için çok aşamalı bir filtre sisteminin devreye girmesi esastır. Kötü filtrelenmiş deniz suyu (örneğin, önceki kültür sisteminde 25 μm örgü) kullanarak, kültür genellikle özellikle yaz aylarında kararsız, potansiyel fitoplankton yüksek bolluk nedeniyle. Bazı fitoplanktonlar O. dioica büyüme için yararlı olmasına rağmen, diğerleri O. dioica embriyoların anormal gelişimine neden olabilir biyotoksinler üretmek48. Buna ek olarak, Chaetoceros spp. gibi diatomların yüksek konsantrasyonda onlar ev tıkanmak ve verimli besleme önlemek uzun setae sahip olabilir gibi O. dioica büyüme için potansiyel olarakzararlıdır 49. C. calcitrans setae tarafından tıkanmış küçük hayvanların evlerini sık sık gözlemledik; bu nedenle, şimdi C. calcitrans sadece Gün 2 ve daha büyük hayvanlara beslemek (Tablo 3).
Burada bir sorun olmamasına rağmen, O. dioica küçük ölçekli uzun vadeli culturing genetik bir darboğaz nedeniyle nüfus boyutunda ani düşüşler yaşayabilir; bu gibi durumlarda, Martí-Solans ve ark.29 kültüre her 20 nesilde bir yeni vahşi bireyler eklemeyi önerir.
Oikopleura kültür sistemi esnektir. Bir hafta içinde istikrarlı bir kültür kurulabilir. O. dioica uzun vadeli culturing olmayan uzman ekipman ile mütevazı bir bütçe ile mümkündür. Oikopleura 5-10 beaers bakımı için gerekli günlük çaba genellikle 2 kişi ile 2 saatten azdır. O. dioica da doğal deniz suyuna erişimi olmayanlar için yararlı yapay deniz suyu,28muhafaza edilebilir. Alg gıdauzun uzun süreli depolanması katı kültür ve kriyopreservation29kullanılarak mümkündür. Ayrıca, O. dioica sperm kriyoopreserved olabilir, ve bir yıldan fazla canlı kalır50. Tüm bu faktörler kültürlerin kolayca yeniden kurulabileceği anlamına gelir. Son olarak, Pleurobrachia spkazara culturing ile geçmiş deneyim . Oikopleura için geliştirilen kültür sisteminin potansiyel olarak daha geniş bir kırılgan pelajik organizma topluluğuna genişletilebileceği düşündürebilir.
O. dioica çeşitli biyolojik alanlarda güçlü anlayışlar sağlamaya devam etmektedir. Yerel mevsimsellik anlayışı, titiz bir kültür sistemi ve birkaç adanmış bireyler, az çabayla etkili bir kültürün kurulmasına olanak sağlar. Oikopleura kültür sistemi, ekoloji, geliştirme, genomik ve bu eşsiz deniz kordatevrimi ile ilgili çok çeşitli biyolojik alanları araştırmak için temel kaynaklar sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Garth Ilsley’e kültür sisteminin kurulmasına verdiği destek ten dolayı minnettarız. Ritsuko Suyama ve Sylvain Guillot’un erken örnekleme ve türlerin tanımlanması çabalarına katkılarını kabul ediyoruz. Özel teşekkür Hiroki Nishida, Takeshi Onuma ve Tatsuya Omotezako onların cömert destek ve rehberlik boyunca, yerel kültür sisteminin ilk kurulması ve hayvan ve mikroalgal kültürünün paylaşımı da dahil olmak üzere kaynaklanmaktadır. Ayrıca Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro ve Alfonso Ferrández-Roldán’a örnekleme ve kültür çıkarma konusundaki uzmanlıklarını paylaştıkları için teşekkür ederiz. Jai Denton, Charles Plessy ve Jeffrey Jolly el yazması hakkında paha biçilmez geribildirim sağladı. Charlotte West alg hesaplaması için genelleştirilmiş bir denklem formüle etti. Son olarak, finansman için OIST teşekkür, Mary Collins ve Güvenli örnekleme prosedürleri tavsiye için OIST Fieldwork Güvenlik Komitesi, kültür ve örnekleme ekipmanları inşaatı için OIST makine mağazası personeli ve deniz suyu teslim için Koichi Toda.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |